显然，CT值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量， CT值是一个完全客观的参数。CT值越小，模板DNA的起始拷贝数 越多；CT值越大，模板DNA的起始拷贝数越少。正常的CT值范围 在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。
实验方案的设计
根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和 绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理 的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百 分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷 贝数或浓度。
Ct=-klgX0 +b
CT值的确定
Rn（Normalized reporter）:是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光 发射强度的比值。 △Rn:是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn = Rn – 基线）。 基线:在PCR的最初几个循环中，荧光信号是几乎不变的，这确定了扩增图中的基 线。基线范围的定义是从第3个循环起到CT值前3个循环止，一般取第3到第15个 循环之间。在这些初始的循环中，我们看到的其实是反应的荧光背景。 阈值: 用于确定实时定量分析中的CT值的某个△Rn水平。一般将PCR反应前15个循 环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的 10倍，这个水平设定得比基线高，又在扩增曲线的指数增长区域内足够低。 阈值循环（CT）：荧光穿过阈值时的循环数,即阈值与扩增曲线的交叉点。
TaqMan MGB探针
TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通 的TaqMan探针和TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非 荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光， 可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此 为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更 短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。因为在 模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。 实验证明，TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为 理想。
能计算出起始DNA拷贝数。
荧光定量PCR的优势
在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物 质,随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计， 荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集 一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变 化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
实时荧光定量PCR原理 和实验
为什么终点定量不准确？
我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲 线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增 多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种 PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐 减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种 环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平 台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各 种条件基本一致,最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大。
为什么不选普通PCR?
对于绝大多数实验，比如甲肝的诊断、药物疗效的监测 等,需要测定的都是PCR放大之前标本中的DNA原始拷 贝数,经过PCR扩增以后的DБайду номын сангаасA拷贝数已经不能反映真 实情况。在这种情况下，就不能采用终点定量，而要根 据CT值确定DNA起始拷贝的数量。
传统的定量方法，如溴乙锭染色或放射性核素掺入标记 后的光密度扫描等，测定的都是PCR的终产物，而不 是起始DNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板 量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不
TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是 利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧 光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号 的强弱就代表了模板的数量。
在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与 模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团 (Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如 TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器 检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其 3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收， 即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个 同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高 了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收 集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值， 从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义 上的DNA定量。
CT值与模板DNA的关系
一般地，我们有Rn=RB+XO(1+EX)nRS,也就是说第n次PCR循环时 的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上每个分子的荧光强度 (即单位荧光强度，RS)与分子数目的乘积。当循环次数n = CT时， 则有RT=RB+XO(1+EX)CTRS。两边取对数，得log(RT -RB) = logX0 + CTlog(1+ Ex) + logRs。整理此式，CTlog(1+ Ex) = logX0 + log(RT -RB)–logRs。
根据所使用的技术不同，荧光定量PCR又可以分为 TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种方法。比较 而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精 确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。 在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来 决定。
TaqMan探针技术原理