相对定量
典型应用领域: mRNA 表达水平的检测(e.g. 细胞因子, 肿瘤) 基因定量 (e.g. 染色体缺失) 研究疾病的微小残留病灶(MRD) GMO 检测…
检测病原体载量(e.g. legionella, anthrax)
筛选抗生素抗性基因(e.g. MRSA, VRE) 水质监测…
qRT-PCR的定量分析方法
RNA提取及逆转录
• 注意事项 样品量和Trizol的加入量一定要按比例，不能随意增加样品量或 减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降 解。 实验过程必须严格防止RNase的污染。 DNase （RNase-free） RRI （Recombination RNase Inhibitor）
GAPDH 5.8S,18S, 28S RNA ß2-microglobulin G6PDH PBGD aldolase HPRT U3, U8, ... ornithin decarboxylase ... multigene family; 10-30 genes; > 200 in mouse mostly pseudogenes pseudogenes no pseudogenes no pseudogenes no pseudogenes pseudogenes pseudogenes Pseudogenes : tumors : lung, pancreatic, colon cancer : insulin, EGF : Non-Hodgkin lymhoma abnormal expression in tumors : kidney, stomach tumor : hormones, oxidant stress, growth factors
qPCR
数据分析
样品处理
细菌样品 收集1-5*109细菌，置于液氮 研磨，加入1mL Trizon，混匀，高温（55℃） 细胞样品 收集1-5*107细胞，加入1mL Trizol，混匀，进行RNA提取或者放置于-80℃冰箱 动物样品 取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5 mL离心管中，加入 1ml Trizol充分匀浆。
逆转录-实时荧光定量PCR （RT-）qRT-PCR
（RT-）qRT-PCR （Reverse transcription） quantitative real time PCR RT-PCR Reverse transcription-PCR Real-time PCR
样品处理
RNA提取 及逆转录
qRT-PCR的标记方法
特异性荧光标记 • Taqman探针法
与目标序列互补
• TaqMan探针的特性： (1).5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 (2).3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) (3).探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分 开，发荧光 (4).Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
RNA提取及反转录
• 将处理好的样品置于室温，静置5 min • 加入0.2mL氯仿，振荡15s，静置5 min • 4℃离心，12000g× 15min，取上清 • 加入等体积异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min • 4℃离心，12000g× 10min，弃上清 • 加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g× 5min，弃上清 • 晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min）。
qRT-PCR的标记方法
非特异性荧光标记 • 熔解曲线
• 对PCR产物加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度 下降，到达某一温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降。利用该特 点以及不同PCR产物其Tm值的不同，因此使其荧光信号发生迅速下降的温 度也不同，可通过此对PCR的特异性进行鉴定。
表达水平在所有样品中是持续、稳定的：正常组织 vs. 肿瘤组织 表达水平不受实验条件变化的影响：处理样本 vs. 未处理的样本
Gene Genomic structure / pseudogenes
• 看家基因 (Housekeeping genes) ß-actin multigene family; > 20 genes; 1 active locus ：编码有基础细胞功能的蛋白 : hormones of tyroid gland 20 pseudogenes : stomach tumor multigene family; pseudogenes 质 g-actin
• Taqman MGB探针
• 分子信标
qRT-PCR的标记方法
非特异性荧光标记 • SYBR Green Ⅰ是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有 绿色激发波长的原料。
qRT-PCR的标记方法
非特异性荧光标记 • SYBR Green I作用原理
qRT-PCR的标记方法
非特异性荧光标记 • SYBR Green I标记注意事项 • SYBR Green I与任何dsDNA进行结合后散发荧光，因此如果反应 体系中有非特异性扩增或者引物二聚体的生成，也将同时被检测， 从而导致检测结果不准确。 • 设计合适引物，防止非特异性扩增。 • 反应结束后必须做熔解曲线分析。
qRT-PCR的定量分析方法
相对定量分析方法 • 内参基因的作用：利用内参基因 (=内源性对照) 对样本间的差异 进行归一化处理 • 内参基因可以修正： 样品起始量的差别 样品中核酸回收率的差别 样品中可能的RNA降解 不同样品中核酸质量的差别 加样差
qRT-PCR的定量分析方法
相对定量分析方法 • 理想的内参基因
与常规PCR技术比较 常规PCR对扩增终产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准 确定量，无法对扩增反应实时监测。
qRT-PCR的化学原理
• 起点定量：起始DNA量是样本中原来的DNA量，更有意义，重现 性好，误差小。 • 终点定量：终点DNA的量是经过PCR放大的量，存在部分“失 真”，并非研究所期望的数据，误差大。
qRT-PCR的化学原理
• 典型的PCR扩增四个阶段
qRT-PCR的化学原理
• 三个概念
基线（Baseline）：是指在PCR扩增反应 的最初数个循环里，荧光信号变化不大。 接近一条直线，这样的直线即是基线。
荧光域值（threshold）的设定：一般将 PCR反应前 15个循环的荧光信号作为荧 光本底信号，荧光域值是PCR 3-15个循 环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设 定在 PCR扩增的指数期。
绝对定量分析方法
• 绝对定量一般通过标准曲线来确定目的基因在样本中的分子数目，即通常所 说的拷贝数。 • 绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。
qRT-PCR的定量分析方法
绝对定量分析方法 • 标准品的制备 • 严格意义上的操作要求将PCR产物切胶后进行胶回收，并进行质 粒的连接、转化到感受态大肠杆菌中，质粒在大肠杆菌中增值后 提取质粒，并用分光光度计测定含有PCR产物的质粒的OD值，借 此来确定质粒的摩尔量，将已知摩尔量的质粒做5倍或10倍的连 续梯度稀释，做成质粒标准品，这是准确测定样品中目的基因模 板量的定量基础。 • 现在也有的不做质粒，直接测定纯化后的PCR产物的摩尔量，然 后梯度稀释PCR产物，以此来作为标准品。
qRT-PCR的数学原理
在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) log(1+Ex) *Ct= -log X0 + log M (4) Ct= -log X0 + log M (5) log(1+Ex)
qRT-PCR的定量分析方法
绝对定量分析方法 • 标准品拷贝数计算
标准曲线的绘制
未知样品的绝对定量
qRT-PCR的定量分析方法
相对定量分析方法 • 绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用，但在 有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对 基因表达差异即可。如X基因在经过某种处理后表达量是增加了 还是减少了，这时只需要用相对定量的方法就可以得到结果，而 不需要对标准品进行定量来确定浓度。由于系统误差的原因，不 同的样品很难获得相同量的RNA，这时就有必要引入管家基因来 对所有样品进行归一化处理(RNA 量校正)，然后再对不同样品之 间的目的基因表达量进行比较。
qRT-PCR的化学原理
• 三个概念
Ct值：C(Cycle)，t（threshold）表示每个 PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所 经历的循环数。研究表明，各模板的Ct值与 该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，Ct值越小。反之亦然。利 用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线， 其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标 代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值， 即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝 数。
qRT-PCR的标记方法
特异性荧光标记 • Taqman探针法工作原理
每扩增一条DNA分子， 释放一个荧光信号， 可以在循环过程中任 一点检测荧光
qRT-PCR的标记方法
特异性荧光标记 • Taqman探针的设计原则
qRT-PCR的标记方法
特异性荧光标记 • Taqman探针法
• 优点
(1).极高的特异性和准确性：由于探针法除了引物序列的特异性之外，还有探 针序列的特异性，从两个方面保证了所 扩增基因的特异性。 (2).良好的重复性