实验十五动物细胞培养技术及其应用一．实验目的通过本实验使学生掌握细胞培养、细胞检测和细胞表达等成套技术的原理和方法。
二. 实验内容1.培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏等基本技术；2.细胞生长曲线测定、细胞活性检测等常用技术；3.细胞污染检测方法与技术；4.病毒在细胞中的感染与增殖、重组病毒异源蛋白的细胞表达等实用技术。
三．实验用品1. 材料：Sf 细胞、Hi5 细胞等2. 器材：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、培养基抽滤装置、电泳仪、离心机、pH计、液氮罐（含液氮）、水浴锅、温度计、培养瓶、血清瓶、5 ml和10 ml 移液管、不锈钢移液管筒、大小不锈钢饭盒、酒精灯、吸耳球、血球计数板、96孔板、24孔板、无菌冻存管、离心管、记号笔、一次性过滤器、微量加样器、精密pH试纸、酒精棉球等3. 试剂与药品：Grace培养基、胎牛血清、甘油、DMSO、双抗（青霉素、链霉素）100 u/ml、Hank’s液、胰蛋白酶、台盼蓝、液氮、分析纯无水酒精、95%医用酒精、Tris碱、硼酸、EDTA、琼脂糖粉（电泳用）、dNTPs、Taq酶、支原体检测试剂盒、DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue kit （Qiagen）等。
四．实验方法与步骤（一）培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏1. 缓冲液及培养基配制Hank’s液：KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml，高压灭菌。
4℃下保存。
胰蛋白酶液：称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。
4%台盼蓝染液：称取台盼蓝4克，加双蒸水至100 ml。
MTT溶液：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的Hank’s液中。
4℃下保存。
Grace培养基：取一份GIBCO公司的Grace培养基粉剂，按说明用量加入1000ml三蒸水100单位／毫升青、链霉素，充分混匀使溶解，调节pH值至6.8左右。
0.22μm 滤膜抽滤除菌，4℃下保存。
此为基础培养基。
使用前加入10%胎牛血清。
细胞冻存液：基础培养基加入10%DSMO，20%胎牛血清，用前配制。
PBS缓冲液：137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.1 mmol/L Na2HPO4, 1.5 mmol/L KH2PO4,pH 7.0, 121℃（15磅）消毒20min。
弱硫酸洗液：重铬酸钾 10g，粗浓硫酸 200ml，水 100ml。
先称取粗制重铬酸钾10g，放于大烧杯内，加普通水100ml使重铬酸钾溶解（必要时可加热溶解）。
再将粗制浓硫酸（200ml）缓缓沿边缘加入上述重铬酸钾溶液中即成。
加浓硫酸时须用玻璃棒不断搅拌，并注意防止液体外溢。
若用瓷桶大量配制，注意瓷桶内面必须没有掉瓷，以免强酸烧坏瓷桶。
配时切记，不能把水加于硫酸内（将因硫酸遇水瞬间产生大量的热量使水沸腾，体积膨胀而发生爆溅）。
2. 培养瓶等玻璃制品的清洗与消毒（1）细胞培养用玻璃制品的清洗包括洗衣粉液浸泡、刷洗、自来水冲洗及酸泡等步骤。
酸泡24小时后，用流水冲洗将酸液完全清洗掉，然后用蒸溜水浸泡和冲洗数次，烘干备用。
注意接触洗液时必须戴防酸手套以防护。
（2）将培养瓶或移液管等分别放入消毒盒或筒中，121℃（15磅）消毒30min，烘干后备用。
3. 细胞培养与传代（以昆虫细胞Tn-Hi5为例）在培养瓶中细胞生长成单层，铺满瓶底时就需要传代了。
传代步骤如下：（1）倒置显微镜下观察细胞形态和生长状态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。
（2）用0.1％新洁尔灭溶液或70% 酒精擦净超净台台面。
打开超净台的紫外灯照射台面20 min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。
（3）操作前用肥皂洗手，用70％酒精擦拭消毒双手。
（4）点燃酒精灯；将培养瓶瓶口用70％酒精消毒，过酒精灯火焰后放置于酒精灯旁。
（5）在火焰周围打开培养瓶瓶盖，用无菌移液管按比例吸取5~10 mL Grace 完全培养基，小心吸打几次，以将瓶底的细胞吹起混匀，再将细胞悬液均匀分装到新的培养瓶中。
（6）对于贴壁很紧的细胞，先倒掉培养瓶中的旧培养基，再向培养瓶中加入1 mL胰酶，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。
加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(3～5mL／小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。
（7）将传代细胞放到培养箱中， 28℃培养。
每隔24 hr 在倒置显微镜下观察，待细胞又长成单层时再次进行传代。
4. 细胞冻存（1）预先配制冻存液：含20%血清培养基，10% DMSO。
（2）取对数生长期细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清。
加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106～1×107细胞/ml)。
（3）在安倍瓶或冻存管中加1～1.5 ml细胞悬液，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。
（4）将封好的安倍瓶或冻存管置于塑料盒或小袋，以1℃／min 速率进行冷冻，在30～40 min 内使其到达液氮表面，再停30分钟后，将其投入液氮中，-70℃冻存可达数年。
5. 细胞复苏（1）检查冻存记录，确定将要复苏的冻存管的位置。
（2）将冷冻管迅速由液氮转入到37℃水浴中，冷冻管的顶部保持在水面以上以避免任何污染，不定时搅拌加速解冻。
（3）当细胞完全解冻后，用70%乙醇擦拭冷冻管进行消毒，然后在超净台内打开冻存管。
（4）用1ml移液管将解冻后细胞转移到培养瓶中，将培养基缓慢加到细胞悬液中以稀释细胞和保护剂。
（5）将细胞置于28℃培养。
注意在倒置显微镜下观察细胞的生长状态，必要时更换培养基，添加新鲜培养基，直至细胞恢复正常生长状态。
注意：细胞冻存与复苏时需要接触液氮罐中的液氮，请穿实验服并佩戴防护面罩或眼镜以及手套，以免造成机体损伤。
（二）细胞生长曲线测定与细胞活性检测1. 细胞生长曲线测定（MTT法）（1）取对数生长期细胞用血球计数板计数，将细胞密度调整为5×103、1×104、2×104、3×104、4×104、5×104等6种浓度分别接种到96孔细胞培养板中，每个浓度接种6孔，共同时接种7板。
28℃培养。
（2）接种24、48、72、96、120、144、168 hr后，各取一个96孔板，在每孔加入MTT 溶液20μL，继续孵育4hr后终止培养，快速翻转96孔板，倒掉培养液，每孔加入150μL DMSO，震荡10min使蓝紫色甲讃完全溶解，用酶联免疫监测仪检测490nm处吸光值，并以只加培养基而未加细胞的孔为对照调零。
每个浓度取6孔OD值的平均数，实验重复三次。
（3）以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
2. 细胞活性检测（台盼蓝法）（1）取对数生长期细胞制备细胞悬液。
（2）在900uL细胞悬液中加入100 uL 4%的台盼蓝染液，混匀染色5min后，制片观察。
（3）在显微镜下观察，活细胞拒染呈无色，死细胞被染成蓝色。
随机计数视野内死活细胞的数量，计算细胞的存活率。
（三）细胞污染检测方法与技术1. 常见细胞污染类型的初步鉴定细菌污染：短时间内培养基颜色变黄，明显浑浊，在低倍镜下即可见细胞之间空隙处有颗粒物。
真菌污染：短时间内不易察觉，培养基尚澄清。
久之可用肉眼观察到培养基中有菌丝或菌落出现。
用倒置显微镜观察可见丝状或树枝状菌丝。
支原体污染：周期长，用常规方法不易检测，但影响细胞的生长与活性。
如果出现细胞长时间不明原因的生长不良和活性改变，则需进行支原体检测。
2. 细胞支原体污染的PCR检测DNA提取：（1）需要检测支原体污染的细胞系在检测前两周内用不含抗生素的培养基培养，以保证支原体在培养基上清中的效价在PCR测定范围之内。
（2）收集1 mL培养上清液，含活的或死的细胞，13000 g 离心5 min，沉淀用1 mL PBS 重悬浮，涡旋混匀。
（3）再次离心洗涤细胞，用1 mL PBS重悬浮，涡旋混匀。
重离心后，沉淀用100 uL PBS 重悬，涡旋混匀，然后加热至90℃， 15 min。
（4）细胞分解后，用Qiagen 公司的DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue kit提取DNA，-21℃贮存备用。
PCR反应：（1）根据支原体检测试剂盒说明进行PCR。
（2）PCR产物的EB检测。
（四）病毒在细胞中的感染增殖与重组病毒异源蛋白的细胞表达1. 病毒在细胞中的感染增殖与TCID50的测定（1）取对数生长期细胞，血球计数板计数，将细胞密度调整到2~3×105个/ml，接种到96孔微量培养板中，每孔加入细胞悬液100µl。
（2）在24孔微量培养板中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-2到10-10。
（3）将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔细胞，每孔接种100µl。
设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排（100µl生长液+100µl细胞悬液）。
（4）逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
（5）按Reed-Muench法计算TCID50：2. 重组病毒异源蛋白的细胞表达（1）将Sf细胞进行传代培养，取对数生长期细胞进行病毒感染。
（2）将含有GFP基因的AcNPV重组病毒毒液感染Sf细胞，28℃培养。
（3）每隔24hr 在倒置荧光显微镜下观察。
若细胞出现绿色荧光则GFP基因在细胞中得到了表达。