荧光素FITC-N＝C ＋ N-蛋白质→ FITC- N – C – N - 蛋白质 ‖ ‖ S H H H S H
(2)操作流程 抗体与荧光素比例为50-100:1 抗体的准备：20mg/ml(抗体+生理盐水+碳酸盐缓冲液） 碳酸盐缓冲液为总量的1/10。 荧光素的准备：根据欲标记的蛋白总量，每毫克加入0.01mgFITC
2 荧光素的种类：
(1)异硫氰酸荧光素(FITC)
呈黄色、橙黄或褐黄色粉末或结晶，性质稳定，在室温下能保存2年以 上，在低温中可保存多年。易溶于水和酒精。呈现黄绿色荧光。 在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨 基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键,成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。 一个IgG分子最多能标记15-20个FITC分子
最大吸收光谱:570nm 最大发射光谱:596～600nm 分子量：580KD
(3)四甲基异硫氰酸罗达明(TMRITC)
紫红色粉末，罗达明的衍生物，易溶于水，性质较稳定。呈橙红色荧 光，与FITC的黄绿色荧光对比清晰，与蛋白质结合方式同FITC。它可 用于双标记示踪研究。
最大吸收光谱:550nm
最大发射光谱:620nm
二 荧光素
能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光素；
必须具备：吸收激发光的光能并发射荧光。
1 具备用于标记抗体的荧光素条件
(1) 应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易离解，而未
结合的色素及其降解产物易排除。 (2) (3) (4) (5) (6) 荧光效率高，与蛋白质结合后荧光素质量下降不多。 标记后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。 结合方法简便而快速，并且较稳定。 荧光素容易溶解，溶解后不会和其他物质发生化学反应。 荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。
察到的上部不能充分激发光；细胞重叠或杂质掩盖易非特异着色。 (4) 封片剂 常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在 pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/L pH9.0～9.5的碳酸盐缓 冲液等量混合作封片剂（室温过夜，待气泡消失可使用)。
荧光信号增强封片剂 mowiol 40-88 4.8g 甘油 12ml 蒸馏水 12ml 0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml 混合加热溶解，5000g离心，15min，最后加入DABcos，终浓度2.5，溶解后，分装存 于-20℃中。
存档的HE染色标本： 褪去盖片和颜色，再作免疫荧光或其它免疫细胞化学 的染色。
主要内容
一、荧光的特征
二、荧光素
三、荧光素标记抗体的方法 四、荧光抗体的质量鉴定 五、免疫荧光组化染色方法 六、荧光显微镜
七、非特异性荧光的消除方法
八、免疫荧光细胞化学的对照染色 九、激光扫描共聚焦显微镜
一、荧光的特征
结果： A抗原呈黄绿色荧光； B抗原呈桔红色荧光。
5 膜抗原荧光抗体染色方法


原理和步骤：直接法或间接法； 适用：可对活细胞在试管内进行染色，常用于T和B细胞、细 胞培养物、瘤细胞抗原、受体等。 结果：阳性荧光主要在细胞膜上。
6 荧光抗体再染色法
荧光抗原染色法
抗原用荧光素标记，少用。

六、荧光显微镜检查方法
分子都含有电子，电子在不停地运动着。根据量子理论，运 动着的电子可以处于一系列不连续的能量状态中，电子遵守一定的规则， 要以从一个能级向另一能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能量 的吸收或释放。
激发: 当电子吸收能量跃迁到较高能 级，这个过程叫激发。
发射: 以辐射方式跃迁时，能量转化 成相应波长的光，这个过程叫发射。
(4) (5) (6) (7)
4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）---蓝色荧光 得克萨斯红（Texas red） 藻红素R 花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）…

三、荧光素标记抗体的方法
(一)FITC标记抗体的方法 1 Marsshall法
(1)原理：当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖 氨酸-氨基与FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86个赖氨酸残基， 一般最多能结合15～20个。
结果 黄绿色荧光处即阳性细胞分布部位。
3 补体法
用特异性抗体和补体混合液与标本上的抗原反应，补体就结合在抗原抗 体复合物上，再用荧光标记的抗补体的抗体与补体结合，从而形成抗原— 抗体—补体—抗补体荧光复合物。荧光显微镜下所见阳性荧光即为抗原所 在部位。 特点：很敏感，且不受特异性抗体种属的限制，适用于各种动物抗体的 检查方法。 方法： 1）涂片或冰冻切片固定，PBS水洗； 2）滴加免疫血清和补体等量混合液，37℃，30min； 3）PBS洗涤； 4）滴加抗补体荧光抗体37℃，30min； 5）水洗，缓冲甘油封固。 适用：肾穿刺组织活检诊断等；形态小的立克体、病毒颗粒或低浓度抗原。
最大吸收光谱：490～495nm， 最大发射光谱：520～530nm。 分子量：389.4KD

(2)四乙基罗达明(RB200)
褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。呈 明亮橙红色荧光。RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯，在碱性 条件下易与蛋白质的赖氨酸一氨基反应结合而标记在蛋白分子上。
（5）结果
荧光显微镜下观察，呈现黄绿色荧光部分为阳性细胞。
2 间接法
（1）基本原理 先用未标记特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此 抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞 抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。 优点：只需制备一种荧光抗体可检出多种抗原，敏感性较高，能解决一 些不易制备动物免疫血清的病原体（麻疹）等的研究和检查，广泛应用于自 身抗体和感染病人血清的检验。 缺点：非特异性着色机会较多，染色时间长。
荧光抗体的保存


0-4℃或-20℃低温保存，防止抗体活性降低和蛋白变性； 加入防腐剂：硫柳汞或叠氮钠； 小量分装； 真空干燥后更易长期保存。
五、荧光抗体染色方法
适用标本：涂片、印片、细胞单层培养物或组织切片，经适当固定或不固定； 方法：直接法、间接法、补体法
1 直接法
（1）基本原理 用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗 体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部 位呈现特异性荧光。 特点：适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮 肤的检查和研究。但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较细胞组织标本上需要同时显示两种抗原。 方法：如A抗原的抗体--- FITC 标记， B抗原的抗体--- RB200标记。 (1)一步双染法 将两种标记抗体按适当比例混合（A+B)； 直接法进行染色反应。 (2)二步双染法 先用RB200标记的B抗体,不必洗去； 再用FITC标记的A抗体染色； 按间接法进行。
第四章
免疫荧光细胞化学技术
免疫荧光细胞化学技术
(immunofluorescence cytochemistry)
采用荧光素标记的已知抗体或抗原作为探针， 检测待测细胞或组织内的靶抗原或抗体，形成带有荧 光素的抗原抗体复合物。利用荧光显微镜观察标本， 根据组织细胞中荧光物质的存在，确定抗原或抗体的 性质并定位，以及利用定量技术测定含量。
（2）器材
荧光显微镜，恒冷箱切片机，剪刀，镊子，载玻片。
（3）材料和试剂
FITC—sIg；0.01MPBS(Ph7.2)；100%丙酮；甘油缓冲液。
（4）操作步骤
1）恒冷箱切片，厚5μm，风吹干燥30min。 2）100％冷丙酮固定lOmin。 3）0.01M PBS漂洗3次，5min/次。 4）滴加1：50—100的FITC—sIg，室温或37℃湿盒内染色30min。 5）0.01M PBS漂洗3次，5min/次。 6）封片，镜检。 7）阴性对照：采用正常血清染色，结果为阴性。
结合（标记）：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体溶液中（5-10min)。 避免粘于瓶壁或搅拌棒上，继续搅拌12-18h，4℃ 透析：离心去沉淀，装入透析袋pH8.0缓冲盐水透析过夜，0-4℃ 过柱：葡萄糖凝胶G50或 G25柱 分离游离荧光素 保存 4℃ -40℃等量甘油分装保存。


2 Chadwick法 3 改良法 4 透析标记法

荧光 (fluorescence)
跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重 激发态以辐射方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短， 发射持续的时间也很短，这种发射光，叫荧光。 即指一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引起发光，停止能量供 给，发光也瞬时停止(一般持续lO-7～lO-8s)。
BP530-550 BP480-550
BA590
罗丹明
四甲基罗丹明异硫氰酸盐：荧光抗体观察 碘化丙啶：DNA
IG
DM565
BP520-550
BA580IF
DM600
BP545-580
BA610IF
德克萨斯红：荧光抗体观察

2 标本制作要求
(1) 载玻片厚度应在0.6～1.2mm之间（有时需石英玻璃载玻片) (2) 盖玻片应光洁，厚度在0.17mm左右（有时需干涉盖玻片) (3) 标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观
1 荧光显微镜
超高压光源、滤板系统(包括激发和压制滤板)、光学系统和摄影系统等 主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光。
（1）光源 光源的亮度应根据荧光素的类型选择。小功率汞灯可满足激励一般荧光染料 的要求。对于免疫荧光染色需用大功率超高压汞灯。其工作时，两个电极间 放电，引起球内水银蒸发，经过5～15min，球内气压升至50～70标准大气压， 此时达到最高亮度，成为稳定工作状态。 （2）滤板系统：包括激发滤片，阻断滤片、隔热滤片，分光镜和其他中性 滤片。是荧光显微镜的重要组成部分，是获得特定波长光，清晰的荧光影像 和发挥显微镜最佳性能之关键。了解滤片性能，正确地选择滤片是观察荧光 效应的前提和必要条件。