本科毕业论文题目红佳酿酵母β-葡萄糖苷酶酶活测定条件优化学院食品科学与工程学院专业生物工程毕业届别2014届姓名贾滔指导教师王婧职称副教授甘肃农业大学教务处制二〇一四年六月目录摘要 (1)前言 (2)1 材料与方法 (2)1.1 试验材料 (2)1.1.1 供试菌株 (2)1.1.2 主要药品 (3)1.1.3 供试培养基 (3)1.2 试验方法 (3)1.2.1 菌株活化 (3)1.2.2 粗酶液的制备 (3)1.2.3 β-葡萄糖苷酶活力的测定 (4)1.2.3.1 标准曲线绘制 (4)1.2.3.3 酶活力计算 (4)1.2.4 酶活力测定条件的优化 (4)1.2.4.1 单因素试验 (4)(1) 反应时间的选择 (4)(2) 反应温度的选择 (4)(3) 缓冲液pH值的选择 (5)(4) 底物浓度的选择 (5)1.2.4.2 酶活力测定的正交试验 (5)1.2.5 数据处理统计 (5)2 结果与分析 (6)2.1 单因素试验结果分析 (6)2.1.1 反应时间对酶活力的影响 (6)2.1.2 反应温度对酶活力的影响 (6)2.1.3 底物浓度对酶活力的影响 (7)2.1.4 缓冲液pH对酶活力的影响 (7)2.2 正交试验 (7)2.2.1 数据处理统计 (8)3 讨论 (9)4 结论 (9)参考文献 (10)致谢 (11)红佳酿酵母β-葡萄糖苷酶的酶活测定条件优化贾滔（甘肃农业大学食品科学与工程学院生物工程班2010级）摘要：以红佳酿酵母菌株为出发菌株，对其β-葡萄糖苷酶的酶活性测定条件进行研究。
通过单因素试验研究了缓冲液pH值、反应时间、反应温度、底物浓度对β-葡萄糖苷酶活力的影响，并采用正交试验确定了最佳酶活测定条件。
结果表明：缓冲液pH值5.0；反应时间为10min;反应温度为50℃；底物浓度为40mmol/L，在此条件下红佳酿酵母β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力最高，达到47.58±0.58U/mL。
关键词：红佳酿；β-葡萄糖苷酶；酶活;测定方法；优化To optimize the measurement conditions about enzyme activity ofvintage r ed β- glycosidaseJia Tao（Gansu Agricultural University Food science and engineering college Biologicalengineering class The class of 2010）Abstract: In order to research the measurement conditions about enzyme activity of β-glycosidase ，use vintage red strains for test strains．The effect of buffer pH value，reaction time，temperature and substrate concentration on enzyme activity of β- glycosidase was studied by the method of single factor experiment，and we determines the best conditions for the enzyme activity by applying the orthogonal test ．The results showed that enzyme activity of Red wine yeast β- glycosidase is the highest under the condition of buffer solution pH value was 5.0，reaction time was 10min，temperature was 50℃and substrate concentration was 40mmol/L．Reached 47.58 ±0.58U/mL。
Key words : Vintage red; β-glucosidase; Activity; Determination; Optimization前言β-葡萄糖苷酶（β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21），全称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶（cellobias，CB或β-G）和苦杏仁苷酶。
它属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。
1837年，Liebig 和Wohler 首次在苦杏仁中发现β-葡萄糖苷酶[1]，因此苦杏仁成为了β-葡萄糖的经典来源。
随着现代科学的不断进步，在很多地方都发现β-葡萄糖苷酶较普遍的来源是植物的种子和微生物。
β-葡萄糖苷酶主要用于纤维素的降解[2]、葡萄酒的增香[3]等。
β-葡萄糖苷酶可水解糖苷键合态风味前体物，是葡萄酒风味修饰的关键酶[4]。
葡萄酒中的β-葡萄糖苷酶来源于葡萄果实、商品酶制剂（多源于丝状真菌）、酵母（酿酒酵母和非酿酒酵母）和乳酸菌[5]，其中酵母来源β-葡萄糖苷酶在酿造过程中起着重要作用[6]。
因此建立葡萄浆果和葡萄酒中β-葡萄糖苷酶活性的快速准确的分析方法，对于增强葡萄酒中的香气和提高葡萄酒的质量意义重大。
β-葡萄糖苷酶的活性测定方法很多，常见反应底物有对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)、纤维二糖、水杨苷等。
由于酶与pNPG作用产生的对硝基苯可用分光光度法在400 nm处测定，方法简单、反应快速、反应活性大，所以大多数实验采用pNPG作为底物的分光光度法测定酶活性[7]。
但据文献中p-NPG法测酶活力时所用的反应时间、反应温度、反应pH和底物浓度等条件各不相同，因此不同来源β-葡萄糖苷酶酶学性质有较大差异，导致酶活力定义有所不同，使得各文献中菌株酶活力的大小难以比较[7]。
本试验采用国内目前葡萄酒产业普遍应用的商业酿酒酵母中胞外酶活较高的菌种之一红佳酿酵母菌（VR），对其所产的β-葡萄糖苷酶的测活条件进行优化。
通过单因素及正交试验优化酶活力测定条件，旨在为统一酵母来源β-葡萄糖苷酶活力测定方法，促进高产菌株筛选及其产酶条件的研究提供理论依据。
1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 供试菌株商品酵母：Vintage Red(VR)，意大利Enartis公司。
1.1.2 主要药品p-NPG(4-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside，纯度＞98%)，美国Sigma公司；蛋白胨，酵母浸粉购自北京奥博星生物技术有限责任公司；对硝基苯酚（p-NP）购自天津市凯信化学工业有限公司；葡萄糖，无水磷酸氢二钠，柠檬酸，无水碳酸钠等均为国产分析纯。
1.1.3 供试培养基YPD液体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，超纯水，pH5.0；121℃灭菌20min。
产酶（发酵）培养基：酵母浸膏1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，NH4NO3 0.3%, KH2PO4 0.4%,121℃，灭菌20min, 在温度降为70℃左右加入0.1% 对硝基苯酚β-D葡萄糖苷( p-NPG)。
1.1.4 主要仪器与设备CP214电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司)；HH-S型恒温水浴锅（金坛市恒丰仪器制造有限公司）；Genesis 10s紫外可见分光光度计(美国Thermo Scientific公司)；GZX-GF101-II电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)；18100摩尔超纯水机(重庆摩尔水处理设备有限公司)；H2050R台式高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；NRY-200空气恒温摇床(上海南荣实验室设备有限公司)；SW-CJ-2FD洁净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；SPX-150-II生化培养箱(上海跃进医疗器械有限公司）；1.2 试验方法1.2.1 菌株活化按推荐用量（0.2g/L）称取5℃保存的供试商品活性干酵母（红佳酿），接种至50倍体积的YPD液体培养基中，37℃活化20min。
1.2.2 粗酶液的制备活化后的菌株按10%接种量接种至装有50mL(250mL 三角瓶)的发酵培养基中，28℃，180r/min ，摇床培养48h ，将发酵液8000r/min 离心10min ，去除沉淀，收集上清液即为粗酶液。
试验重复3次。
1.2.3 β-葡萄糖苷酶活力的测定 1.2.3.1 标准曲线绘制称取对硝基苯酚139.0mg ，用蒸馏水定容至1000mL ，分别吸取该溶液1.0mL 、2.0mL 、3.0mL 、4.0mL 、5.0mL 、6.0mL 于100mL 容量瓶中，用1mol/L Na 2CO 3溶液定容后混匀。
以蒸馏水作为空白，于400nm 处测其吸光值。
以p-NP 溶液浓度（μg/mL ）为横坐标，吸光度（y ）为纵坐标绘制标准曲线方程，得线性回归方程、相关系数分别为：y=19.882x+0.0017，R2=0.9991，n=5。
1.2.3.2 β-葡萄糖苷酶活力性测定胞外酶：取100μL 上清液，加入200μL p-NPG （5mmol/L 溶于pH 值5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，P-C 缓冲液）混匀，50℃反应30min ，立即加入2mL 1mol/L Na 2CO 3终止反应并显色，于400nm 下测定吸光值[8]。
摩尔消光系数为：ε=18300M-1·cm-1[9]β-葡萄糖苷酶酶活力单位（U ）定义为：在pH5.0，50℃反应条件下， 1毫升酶液1分钟水解p-NPG 产生 p-NP 的量（nmol ）为一个酶活单位（U ）1.2.3.3 酶活力计算NVc U ⨯=1.0*t *酶活式中：U 为酶活力单位（U/mL ），c 为对硝基苯酚的浓度，V 为反应体系的体积，N 为原酶液稀释倍数，t 为反应时间，0.1为所取上清液或细胞液的体积。
1.2.4 酶活力测定条件的优化 1.2.4.1 单因素试验 (1) 反应时间的选择取 0.1mL 粗酶液与 0.2mL 5mmol/L p-NPG （pH 值5.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液配制）混匀，在50℃条件下10min 、 20min 、40min,、50min ，加入2mL 1mol/L Na 2CO 3终止反应并显色，于400nm 下测定吸光值计算其酶活力，试验重复三次，确定最佳反应时间。
(2) 反应温度的选择取0.1mL 粗酶液与0.2mL 5mmol/L p-NPG（pH值5.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液配制）混匀，分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃条件下反应10min，加入2mL 1mol/L Na2CO3终止反应并显色，于400nm下测定吸光值计算其酶活力，试验重复三次，确定最佳酶促反应温度。