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● 操作方法
操作流程见图 1，分为病毒裂解、RNA 或 DNA 与膜结合、RNA 或 DNA 纯化等步骤，病毒裂解后的操作约需 20 分钟（如果起 始材料为感染病毒的组织则需要经过液氮研磨），详细说明如 下：
1. 病毒的裂解： 使用不同的实验材料需采用不同的裂解步骤，具体说明如下：
◆ 血浆、血清、无细胞体液、病毒原液中病毒的裂解： ① 取 10～200 μl 的血浆、血清、无细胞体液、病毒原液，
10~100 μl 的全血，如果起始量不足 200 μl，用 PBS 溶液 或 RNase free dH2O 补足至 200 μl。 ② 加入 200 μl 的 Buffer VGB、20 μl 的 Proteinase K 和 1.0 μl 的 Carrier RNA，充分混匀于 56℃水浴温浴 10 分钟。 ③ 向裂解液中加入 200 μl 无水乙醇，充分吸打混匀。
RNA 或 DNA 溶液
7. 将 Spin Column 安置于新的 1.5 ml RNase free collection
tube 上，在 Spin Column 膜的中央处加入 30～50 μl 的 RNase free dH2O，室温静置 5 分钟。
图 1. 操作流程简图
注）洗脱制备膜上的 RNA 时，请使用 RNase free dH2O。
1.0E+05 copies 的 Flury 株狂犬病毒。
Q2. 本试剂盒的应用范围如何？ A2. 本试剂盒应用范围较广，可进行血浆、全血、无细胞体液、病毒原液和感染病毒组织的 DNA/RNA 提
取。
Q3. 提取的核酸反应性能差，为什么？ A3. ① 提取的核酸中盐份浓度过高。在使用 Buffer RWA 和 Buffer RWB 进行核酸制备膜的清洗时，请沿
8. 12, 000 rpm 离心 2 分钟洗脱 DNA/RNA。
如需获得更大收量，可将离下液重新加入到 Spin Column 膜的中央或再加入 30～50 μl 的 RNase free
dH2O，室温静置 5 分钟后，12, 000 rpm 离心 2 分钟洗脱 DNA/RNA。
9. DNA/RNA 检测。
实验材料
直接裂解或液氮研磨 加 Buffer VGB、Proteinase K 和 Carrier RNA 56℃温浴
裂解液
向裂解液中加无水乙醇 溶液移至 Spin Column 中
弃滤液
Buffer RWA 清洗 Spin Column
Buffer RWB
2. 将 Spin Column 安置于 Collection Tube 上，溶液移至 Spin
图 3. 从 HL60 细胞培养液、全血、唾液、尿液、小鼠肝脏中提取 HAV 病毒 RNA， 并进行 RT-PCR 检测的实验例
3. 从狂犬疫苗 Flury 株中提取 RNA 并进行 RT-PCR 检测的实验例 使用本试剂盒从 10 μl 和 0.1 μl 狂犬疫苗 Flury 株原液中提取 RNA，并使用 TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV) (Code No. RR024)进行 RT-PCR 得到 500 bp 片段，检出感度分别为 1.6E+07 copies 和 1.6E+05 copies，其电泳结果见图 4。
Spin Column 的管壁四周加入，这样有利于提高清洗效果。 ② 洗脱液中残留乙醇，在向 Column 中加入洗脱液之前，将 Column 在室温下静置 2 分钟有助于使
Column 上残留的乙醇彻底挥发，然后再加入洗脱液洗脱。 ③ 进行核酸洗脱时请一定在膜的中央加入洗脱液，尽量不要沾染 Spin Column 的管壁四周。
1 ml 50 μl
12 ml 28 ml 24 ml
2 ml×2 50 支 50 支 50 支
*1 含有强变性剂，应避免与皮肤、衣物等接触。若不小心接触到眼睛或皮肤时，请立即到医院进行处理。 *2 在首次使用前，请添加 56 ml 的 100%乙醇，混合均匀。 【试剂盒之外所需准备试剂】 ◆ 无水乙醇 ◆ PBS 溶液
2. 从 HL60 细胞培养液、全血、唾液、尿液、小鼠肝脏中提取 HAV 病毒 RNA，并进行 RT-PCR 检测的实 验例 使用本试剂盒从 200 μl 培养细胞（HL60）、10 μl 全血、200 μl 唾液、200 μl 尿液、10 mg 小鼠肝脏 中提取 HAV RNA，并使用 TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV) (Code No. RR024)进行 RT-PCR 得 到 289 bp 片段，其电泳结果见图 3。
由于提取时加入了 Carrier RNA，不能通过电泳或吸光度测定定量。可进行 PCR、RT-PCR、qPCR 检
测。
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● 实验例
1. 从甲肝疫苗原液中提取 HAV RNA 并进行 RT-PCR 检测的实验例 使用本试剂盒从1 μl、0.1 μl、0.01 μl 甲肝疫苗原液(分别相当于6.0E+06、6.0E+05、6.0E+04 copies 的 HAV)中提取其 RNA，并使用 TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV) (Code No. RR024)进行 RT-PCR 检测，扩增289 bp 片段，电泳结果见图2。
● 实验材料最大起始量
实验材料 细胞培养液 有核红细胞全血 无核红细胞全血 血浆 无细胞体液 病毒原液 感染病毒的组织
最大起始量 200 μl 10 μl 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl 10 mg
● Q&A
Q1. 本试剂盒的检出感度如何？ A1. 本试剂盒具有高检出度，使用普通的 AMV one step RT-PCR kit 可检出 6.0E+04 copies 的 HAV、
M 12 34 5678 9 + - M
1% Agarose 凝胶电泳图 M：100 bp DNA Ladder（Dye Plus） 1.2：HL60 细胞培养液中 HAV 检测结果 3.4：全血中 HAV 检测结果 5.6：唾液中 HAV 检测结果 7.8：尿液中 HAV 检测结果 9：小鼠肝脏中 HAV 检测结果 +/-：正负对照(Code No. RR024)
● 注意事项
1. 应尽量使用新鲜的实验材料，以确保样品中的 RNA 不被降解。 2. 使用液氮研磨组织材料时，应随时加入液氮，以确保提取的 RNA 不被降解。 3. 部分试剂中含刺激性化合物，操作时请戴上乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤和眼睛等，并应尽量在通风
橱中进行操作。若沾染皮肤、眼睛，要立即用大量清水冲洗，必要时应寻求医疗咨询。 4. 建议用 RNase free dH2O 洗脱。
Spin Column 移至 1.5 ml RNase free tube 上
ห้องสมุดไป่ตู้
请沿 Spin Column 管壁四周加入 Buffer RWB，这样有助于
完全冲洗沾附于管壁上的盐份。
5. 重复操作步骤 4。
RNase free dH2O
6. 将 Spin Column 安置于 Collection Tube 上，12,000 rpm 离 心 2 分钟。
◆ 感染病毒的组织的裂解： ① 取 10 mg 感染病毒的组织进行液氮研磨，研磨后的组织加入
200 μl PBS 溶液或 RNase free dH2O。 ② 加入 200 μl 的 Buffer VGB、20 μl 的 Proteinase K 和 1.0 μl
的 Carrier RNA，充分混匀于 56℃水浴温浴 10 分钟。 ③ 向裂解液中加入 200 μl 无水乙醇，充分吸打混匀。
弃滤液
Column 中，12,000 rpm 离心 2 分钟，弃滤液。
3. 将 500 μl 的 Buffer RWA 加入至 Spin Column 中，12,000
rpm 离心 1 分钟，弃滤液。
4. 将 700 μl 的 Buffer RWB 加入至 Spin Column 中，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃滤液。 注）请确认 Buffer RWB 中已经加入了指定体积的 100%乙醇。
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● 制品说明
本试剂盒是专门用于从血浆、全血、无细胞体液、病毒原液和感染病毒的组织中提取各种病毒（Virus） RNA/DNA 的小量纯化试剂盒。试剂盒采用了独特的病毒裂解系统，由病毒裂解液裂解病毒释放 RNA 或 DNA，再结合核酸制备膜技术纯化 RNA 或 DNA，适用于各种 RNA 或 DNA 病毒的核酸提取。本试剂盒 具有高效、快速、方便之特点，病毒裂解后，提取操作仅需 20 分钟便可完成。本试剂盒配有 Carrier RNA 可提取样品中微量的 RNA/DNA。使用本试剂盒可从低至 1.0E+04 copies 的甲肝病毒或 1.6E+05 copies 的 flury 株狂犬病毒中提取得到 RNA，所得 RNA 可通过 RT-PCR 进行检测。提取得到的 RNA 可用于 RT-PCR 反应、Northern 杂交等多种分子生物学实验。
● 制品内容（50 次量）
本试剂盒分 Part I 和 Part II 两部分。 ■ Part I 部分（-20℃保存）
Proteinase K（20 mg/ml） Carrier RNA
■ Part II 部分（请于室温 15~25℃保存） Buffer VGB*1 Buffer RWA*1 Buffer RWB*2 RNase free dH2O Spin Columns Collection tubes RNase free collection tubes (1.5 ml)
研究用
Code No.9766
TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0