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1欢迎下载 E.Z.N.A.™ 质粒小提试剂盒操作规程（英文版译文）
（适用于No. D6942, D6943 & D6944）
1. 自新鲜划痕选择培养板中分离单菌落，接种含适当选择性抗生素的1-5ml 的LB 培
养基进行培养。

37℃强力摇动（~300rpm ）孵育12-16h 。

使用10-20ml 培养管或容量至少4倍于培养容积的培养瓶。

强烈推荐使用endA 阴性大肠杆菌菌株进行常规质粒分离。

此类菌株包括DH5α和JM109。

2. 将1.5-5.0ml 细菌室温10,000 x g 离心1min 。

轻轻倒出或吸走培养基并丢弃。

3. 加入250μl 的溶液I/Rnase A 重悬沉淀，涡旋或用移液器反复吹打。

充分重悬沉
淀对于获得高质量的DNA 非常重要。

4. 加入250μl 溶液II ，倒置、转动试管数次使之轻轻混匀，得到透明的裂解产物。

可能需要孵育2min 。

不要用力混合，以免使染色体DNA 断裂，减低质粒的纯度。

该步反应不要超过5min 。

溶液II 不用时要拧紧瓶盖，以免试剂被空气中的CO2酸化。

5. 加入350μl 溶液III ，立即倒置试管数次混匀，直至白色絮状沉淀物形成。

为避免
形成局部沉淀，加入溶液III 后应立即、充分混匀溶液。

6. 室温≥10,000 x g 离心10分钟。

白色沉淀物形成，立即进行下一步操作。

7. 小心翼翼．．．．
的吸取上清液，加入装配在2ml 收集管中的小量纯化柱I 中。

确保离心沉淀未受扰动，确保没有细胞碎片加入到柱子中。

室温下10,000 x g 离心1分钟，使裂解液完全通过柱子。

8. 丢弃滤过液，重新使用2ml 收集管；加入500μl HB 缓冲液清洗柱子，室温10,000 x g 离心1分钟，使溶液完成通过柱子。

该步操作需确保残余的蛋白质污染被去除，以保证获得高品质的DNA 以适合于下游的应用。

9. 丢弃滤过液，重新使用2ml 收集管；加入700μl 用无水乙醇稀释的DNA 清洗液清
洗柱子，室温10,000 x g 离心1分钟，使溶液完全通过柱子，丢弃滤过液。

注意：DNA 清洗液的浓缩液使用前必须用无水乙醇稀释（5倍稀释），如果DNA 清洗液稀
释液经过冷藏，则使用之前必须置于室温。

10. 可选步骤：重复清洗，加入另外的700μl 用无水乙醇稀释的DNA 清洗液。

11. 将空柱子≥13,000 x g 离心2min ，使柱子的基质干燥。

此步骤为关键操作，不可
遗漏。

12. 将柱子放入干净的1.5ml 微量离心管中。

将30-50μl （取决于终产物的期望浓度）
洗脱液或无菌去离子水直接加入柱子基质上，使之于室温下静置1-2min 。

≥13,000 x g 离心1min 洗脱DNA 。

可以进行二次洗脱，以收集残存的DNA 。

13. DNA 的产量和质量：分别在波长260nm 和280nm 处测定样品适当稀释液的吸光度。

DNA 的浓度计算如下：
DNA 浓度=A 260×50×（稀释倍数）μg/ml
A 260/A 280的比率可以反映核酸的纯度。

比值大于1.8表明核算的纯度在90%以上。

或者，DNA 的产量（及质量）有时可以通过琼脂糖胶/溴乙锭电泳与已知浓度的DNA 样品相比较更好的予以确定。

通常情况下洗脱的大部分DNA 是超螺旋单体形式，但也可能存在串联体形式。

张小强 翻译。