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邻近效应和定向效应
底物之间及底物对活性部位的邻近和定向 增加了有序性，减小了自由度，从而降低 了系统的熵，而增加了系统的自由能。 双分子反应两个底物在结合部位定向结合 并彼此靠近，比溶液中发生反应的可能性 高得多，相当于大大提高了反应物浓度。 所有酶反应底物和酶之间都有反应所需的 相互作用，定向和邻近使反应加快。 底物结合时墒减少所需要的自由能由底物 结合时放能提供。
2. 有机辅基
生物素可共 价结合羧基。 它通过酰胺 键和蛋白质 的赖氨酸侧 链氨基结合， 形成生物素 羧基载体蛋 白。 （BCCP）
乙酰辅酶A羧化酶
因BCCP能和羧基键合，在羧化反应中起重 要作用。如乙酰辅酶A羧化酶。
磷酸泛酰巯基乙胺
泛酰巯基乙胺可通过 磷酸二酯键和蛋白质 的丝氨酸羟基结合， 形成酰基携带蛋白 （ACP）。ACP在脂肪 酸代谢反应中起着重 要作用。 这些辅基通过共价键 和酶结合，实际上已 成为酶的一个组成部 分。
1. 金属辅因子
已知酶中大约有三分之一以上需要金属离子。 含金属辅基的称为金属酶。有些酶和金属离子 结合不紧密，纯化时失去金属离子，但需加入 金属离子才有活性，称为金属激活酶。此时金 属离子应是金属辅酶。 金属离子参与酶的催化作用的方式有多种： 1）接受或提供电子，或做为亲电剂或亲核剂, 或激活亲电剂或亲核剂； 2）通过配位键结合底物，并引起底物形变； 3）保持反应基团的三维取向，稳定酶活性部 位于活性构象。
——R.Pan et al. JBC,2010；
该酶活性部位含有荧光基团。测定表明该酶 与Th或Ch底物结合后内源荧光有较大变化， 但和U底物结合后变化不大。 用低浓度胍扰动该酶活性部位也造成荧光变 化，但结合过Th或Ch底物后再用胍扰动荧光 变化不大了。 用蚯蚓蛋白酶II、枯草杆菌蛋白酶、乳酸脱 氢酶也能得到类似的结果。 表明这些酶活性部位有较大构象变化后会维 持该构象,再作用按锁钥模型,形成先诱导契 合再锁钥的机制。有无普遍性还需证明。
结合能
邻近效应和定向效应例子
羧基和酯基间可反应生成酸酐。二羧酸单 苯酯的的反应比双分子羧酸和酯的反应速 度快得多，表现了邻近效应和定向效应。
作用物
反应速度
而羧基和 酯之间自 由度越少， 邻近效应 和定向效 应越强， 反应速度 越快。
2）焓因素：形变效应
诱导契合使底物在活性部位结合时出现形 变，造成底物分子内应力，相关键变弱。
诱导契合示意图
底物诱导酶活性部位发生形变，反作用力 使底物也相应形变，达到底物和活性部位 完全契合。诱导契合模型是目前酶学界的 主流认识。
诱导契合—锁钥新模型探索
蚯蚓蛋白酶I有三种蛋白酶活性：凝血酶Th，胰凝 乳蛋白酶Ch，尿激酶U。 发现该酶作用Th 或Ch底物后，U活 性下降。但与U底 物作用后不影响Th 和Ch活性。而Th和 Ch底物刚性，U底 物相对柔性。
催化反应中，酶的催化基团和底物形成 临时共价键，使底物被激活为中间态， 进而实现被催化的反应而生成产物，同 时酶恢复游离态：
这种催化机制称为共价催化。 共价催化包括亲核催化和亲电催化。
亲核催化和亲电催化
如酶分子富含可提供公用电子对的亲核基 团，如氨基、巯基、羟基、咪唑基等，其 提供电子对给带部分正电的底物而形成临 时共价键，这种催化作用就是亲核催化。 由于酶的侧链基团大多是亲核的，亲核催 化是共价催化中的主要形式。 如酶分子含有缺少电子的亲电基团，与富 含未公用电子对的底物形成临时共价键而 完成催化反应的称为亲电催化。
2. 酶催化的热力学原理
过渡态和活化能
化学反应通过过渡态完成，形成过渡态需要活化自由 能。酶促进过渡态形成，并和过渡态结合更紧密。因 此过渡态类似的活化能高， 反应不易进行，速度慢。 与酶结合成复合物时底物 变为过渡态，结合能提供 了所需的活化能。 由复合物进行反应所需要 的活化能就少了。 酶的催化功能主要是由于 降低了反应活化能，从而 提高了反应速度。
亲核催化例
四、酶的辅因子
很多酶有辅因子，包括和酶牢固结合的辅基 以及不牢固结合的辅酶。 辅因子包括金属辅因子和有机辅因子两类。 最常见的辅酶包括NAD，NADP，CoA，核苷二 磷酸或三磷酸和磷酸吡哆醛等，可以把它们 归于底物一类中。 而辅基则可以看做是酶的一部分，一般均结 合在活性中心，成为活性中心的组成部分。
底物在活性部位的结合力
底物和结合部位有形状的配合，使底物 的原子与结合部位的原子有尽可能多的 接近到范德华半径内。 除范德华力，稳定底物结合的力还有离 子间引力、氢键和疏水作用，侧链、辅 基和底物之间存在相应的配合。 按锁钥模型假说，酶的活性中心空间结 构是刚性的。
2. 诱导契合模型假说
后来的研究发现自由酶的活性部位和底物间 并不精确地像锁钥匙一般配合，从而提出了 诱导契合模型假说。 该假说认为，酶与底物结合时，结合力促使 酶和底物分别发生一些构象的变化，从而更 有利于催化反应的发生。构象变化使活性部 位和底物达到精确配合，结合更紧密，并使 催化基团处于更有利于催化的位置上。底物 形变造成应力状态会使发生反应的键变弱， 降低反应的活化自由能，使反应速度增加。 形变所需的能量则是由结合能提供的。
——张子健，博士论文，2013
二、活性部位的催化理论
1. 活性部位的组成 按功能，酶的活性部位包含底物结合部 位和催化基团两部分。 底物在酶上的结合可有效地降低反应所 需的自由能，是酶反应的必要基础。降 低反应自由能的因素包括邻近效应，定 向效应和形变效应。 催化基团实施具体的催化反应。如酸碱 催化，共价催化。
过渡金属酶
过渡金属酶往往通过 多配价键结合，结合 很紧密，一般形成金 属酶。较多见的金属 离子包括锌、铜、钼、 铁、钴等。 羧肽酶A是一个典型 含锌金属酶。活性中 心有一个含锌而结合 C末端的疏水口袋。
羧肽酶A
Zn2＋位于该酶活性中心，和His69，Glu72，His196 以及水以配位键结合。 底物C末端与Arg145侧键通过静电吸引，使底物定 位。 Zn2＋通过吸电子作用促进肽键水解。
酶学及酶工程
Enzymology and Enzyme Engineering
田维熙 教授
中国科学院大学
第二章 酶的结构与功能
第三节 酶的活性部位及 催化机理
一、 酶的活性部位模型假说
1. 锁钥模型假说
锁钥模型假说提出了酶作为生物催化剂有一个 重要特点，即实现催化的必要条件是底物必须 在酶上特异性结合。 酶上存在特定的结合部位，结合部位与底物之 间存在互补的特点，就像锁和钥匙的关系，因 而造成酶催化反应的很强的专一性。结合部位 是酶的活性中心的组成部分。
1. 酸碱催化：酸催化
碱催化
酸碱催化的特点是由广义酸或碱（质子提供 者或接受者）启动，催化反应通过质子和电 子的转移而实现。
酸碱催化可使反应速度提高2到5个数量级。
酶分子中的质子供体和受体
质子供体 -COOH -NH3+ -SH -OH
NH
质子受体 -COO-NH2 -S-ON
N H
N H
2. 共价催化
活性部位的组成成分
形成活性部位的组成成分包括主链结构，侧 链基团和辅基。 主链形成活性部位的基础形状。 侧链基团完成活性部位的构成，是活性部位 的主要成分。 很多酶还包含金属或有机辅基，它们虽不是 肽链的一部分，但紧密结合在酶分子中，并 实际参与了活性部位的形成，有的是结合部 位的一部分，有的本身是催化基团，还有的 能够传递中间产物。
对于磷酸酯 水解反应，有 形变应力的环 状磷酸酯水解 比无应力的开 环磷酸酯快108 倍，表现了底 物形变对反应 速度的影响。
形变效应热力学
键的形变需要吸收一定能量ΔH ，自由能增加。所需 能量也由底物在酶上的结合能提供。其后进行反应时 所需的活化自由能就减少了，这使反应速度加快。
三、酶催化的化学机制
k = ( kb T / h ) e – ΔG/RT
酶降低活化自由能的方式
ΔG = ΔH – TΔS 1）熵因素： 底物结合于酶使其自由度减少，ΔS是负值 而增加系统自由能，据计算常温下反应所需 活化自由能约一半是熵因素贡献的。 底物在酶上结合时，存在临近效应和定向效 应，使系统自由度减少，因此形成复合物时 熵减少。活化自由能中的熵因素在此效应中 实现，其后进行反应时所需的活化自由能就 减少了。