➢Lecture 1 酶学与酶工程➢酶的概念:酶（enzyme）是一类由活细胞产生的，具有催化活性和高度专一性的特殊蛋白质，是一类生物催化剂。

➢➢酶的分类(6类)、组成、结构特点？和作用机制？组成：单体酶、寡聚酶、多酶复合体Note:一个酶蛋白可有多种催化活性，相当于多个酶(关注原核和真核生物的差别) 除水解酶和连接酶外，其他酶在反应时都需要特定的辅酶。

金属在酶催化中的作用：稳定酶构象、参与酶的催化作用（如激活底物）、电子传递体➢酶作为催化剂的显著特点:强大的催化能力：加快反应速度可高达1017倍;没有副反应;高度的专一性：各种酶都有专一性，但专一程度的严格性上有所差别;可调节性;➢同工酶的概念:同一种属中由不同基因或（复）等位基因编码的多肽链所组成的单体、纯聚体或杂交体，其理化及生物学性质不同而能催化相同反应的酶称同工酶。

同一基因生成的不同mRNA所翻译出来的酶蛋白也列入同工酶的范畴。

酶蛋白合成后经不同类型的共价修饰（如糖基化等）而造成的多种酶分子形式，严格来说不属于同工酶而称为synzyme，但也有人称其为次生性同工酶（secondary isozyme）。

不同种属中催化相同反应的酶称为xenozyme，也不属于同工酶。

➢酶的活性中心指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物必需基团(essential group):酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的基团。

活性中心内的必需基团:结合基团（与底物相结合）和催化基团（催化底物转变成产物）活性中心外的必需基团：维持酶活性中心应有的空间构象所必需；构成酶活性中心的常见基团：His的咪唑基、Ser的－OH、Cys的－SH、Glu的γ-COOH。

➢酶的作用机制➢酶活力的调节➢酶的应用食品加工方面：生物技术在食品工业中应用的代表就是酶的应用，目前已经有几十种酶成功用于食品工业。

如葡萄糖、饴糖、果葡糖浆的生产、蛋白质制品加工、果蔬加工、食品保鲜以及改善食品品质与风味等。

常用的酶制剂主要有：淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶、果胶酶、脂肪酶、纤维素酶葡萄糖氧化酶等。

酶在轻工业方面的应用：用酶进行原料处理（发酵原料、淀粉原料、纤维素原料、含戊聚糖的植物原料的处理、纺织原料、造纸原料的制浆、生丝的脱胶处理、羊毛的除垢），用酶生产各种产品（L-氨基酸、核苷酸、酱油或豆酱、制革），用酶增强产品的使用效果（加酶洗涤剂；加酶牙膏、牙粉和嗽口水）酶在医学中的应用：主要的医药用酶、用酶进行疾病的诊断、用酶治疗各种疾病、用酶制造各种药物➢酶与食品质量安全酶制剂作为食品添加剂进入食品的潜在危害酶催化有毒物质的产生酶作用导致食品中营养组分的损失潜在的产毒素性潜在的致病性对策：安全菌株，体外基因毒理学测试，酶制剂的安全评价，酶制剂来源安全性的评估标准➢Lecture 2 基因工程的酶学基础➢核酶（Ribozyme)：概念：具有生物催化功能的RNA。

看课件➢基因工程的酶学基础➢基因克隆表达的过程基因克隆常用的酶，有什么应用，注意事项（补充后两者）➢Lecture 3 酶促反应✧酶促反应的特点与机理：极高的效率（降低反应的活化能），特异性和可调节性特异性：一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并生成一定的产物。

酶的这种选择性称为酶的特异性或专一性。

绝对特异性(absolute specificity)：酶只作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物相对特异性(relative specificity)：酶作用于一类化合物或一种化学键。

立体结构特异性(stereo specificity)：酶仅作用于立体异构体中的一种。

机理：酶-底物复合物的形成与诱导契合假说（酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合）可调节性：对酶生成与降解量的调节酶催化效力的调节通过改变底物浓度对酶进行调节等✧两个假说：锁钥假说，诱导契合假说✧酶促反应动力学：研究各种因素对酶促反应速度的影响①影响酶促反应的因素，Km值的意义，测定（双倒数作图法）影响因素包括有：酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。

（具体见课件）Km的意义和作用：1.Km值等于酶促反应的初速度为Vmax的一半时所需的底物浓度。

2.Km值近似等于ES的解离常数，1/ Km近似地表示酶对底物亲和力的大小。

3.Km是酶的特征性常数，在一定程度上代表酶的催化效率。

4.当、温度和离子强度恒定时，Km只和酶及底物的性质有关，而与酶的浓度无关。

5.一种酶能催化几种底物时就有不同的Km，其中Km最小的底物一般认为是该酶的天然底物或最适底物。

6.当Km已知时，可求得任何底物浓度下酶活性部位被底物分子饱和的分数（FES）。

7.分辨同工酶：测定几个同工酶对同一底物的Km，可估计这组同工酶是原级同工酶还是次生性同工酶，前者的Km常有差异，后者的则比较接近或相同。

8.探讨代谢规律：肌肉中的A型醛缩酶，对果糖-1,6-二磷酸的Km为3µmol/L，对3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮的Km分别为1mmol/L和2 mmol/L ，可知其在体内主要催化糖酵解而难于参与糖异生。

9.有助于寻找代谢的限速步骤：如酶1，2，3分别催化A B C D 三步连续反应，三个酶的Km分别为10 mmol/L，1 mmol/L，0.1 mmol/L ，而细胞内A，B，C的浓度相同，可推知酶1催化的A B为限速反应。

10.指导生化实验：利用工具酶来测定某一底物的浓度时，可根据米式公式的积分式来计算工具酶的用量。

工具酶的Km越大，所需加入的酶量也越大。

鉴别抑制类型V m是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。

②有哪些抑制类型，与Km之间的关系不可逆性抑制：抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合，使酶失活，不能用透析、超滤等方法予以除去。

碘乙酸（ICH2COOH）是一种烷化剂，可使巯基烷化。

有机磷化合物（丝氨酸的-OH磷酯化）、重金属离子及砷化合物可逆性抑制：抑制剂以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。

竞争性抑制:抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。

(丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂/磺胺药对细菌FH2合成酶的抑制).抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及［S］；动力学特点：V max不变，表观K m↑。

可通过增加底物浓度而使整个反应平衡向生成产物的方向移动，因而能削弱或解除这种抑制作用。

非竞争性抑制:抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系。

抑制剂并非结合于活性中心的底物结合位点，而是此位点以外的基团，如催化基团等。

抑制剂与活性中心结合后也不引起底物结合的立体障碍。

如别嘌呤醇竞争性抑制黄嘌呤氧化酶，其氧化产物别黄嘌呤非竞争性抑制黄嘌呤氧化酶。

非竞争性抑制的特点S和E 或ES都能结合，两者结合的亲和力相等,I也能和E 或ES结合，两者的亲和力相等。

S和I与酶的结合既不互相排斥，也不互相促进,抑制程度取决于［I］；动力学特点：V max↓，表观K m不变。

这种抑制作用不能用增加底物浓度的方法来消除。

反竞争性抑制:抑制剂仅与酶和底物形成的中间产物结合，使ES的量下降。

抑制剂只与ES结合;抑制程度取决与［I］及［S］；动力学特点：V max↓，表观K m↓。

混合性抑制作用:S和E 或EI都能结合，I也能和E 或ES结合，但亲和力都不相等。

S 和I对E的结合互有影响。

相当于纯非竞争性和部分竞争性抑制作用的混合系统。

③酶的调剂：酶原调节，变构调节，共价调节酶原(zymogen):有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。

例子：胰蛋白酶原、血液凝固的级联放大作用、胃蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原酶原的激活:在一定条件下，酶原向有活性酶转化的过程。

酶原激活的机理变构调节：一些代谢物可与某些酶分子活性中心以外的部位可逆地结合，使酶构象改变，从而改变酶的催化活性，此种调节方式称变构调节。

变构酶的特点：1、通常具有四级结构，存在协同效应；2、含有催化亚基和调节亚基（或催化部位和调节部位）。

3、[S]-v关系曲线为S形。

一个效应物分子与变构酶的结合，对第二个效应物分子的结合产生影响，这种效应为协同效应。

别构酶举例：天冬氨酸转氨甲酰酶，简称ATCase共价修饰:在其他酶的催化下，酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变酶的活性，此过程称为共价修饰。

磷酸化与脱磷酸化（最常见）/乙酰化和脱乙酰化/甲基化和脱甲基化/腺苷化和脱腺苷化/－SH与－S－S互变特点：受共价修饰的酶存在有（高）活性和无（低）活性两种形式；具有瀑布效应（级联效应）；是体内经济、有效的快速调节方式。

➢Lecture 4 酶的分离纯化➢发酵液的预处理➢细胞的破碎方法➢酶的提取分离方法➢酶的浓缩结晶➢纯化方案的设计与评价➢Lecture 5 固定化酶与固定化细胞➢为什么要固定化酶，酶固定化的优缺点✧固定化酶：指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。

✧为什么要固定化酶：酶的优点和缺点优点：高催化效率；高专一性。

缺点：对环境十分敏感；易失活；不能回收。

固定化生物催化剂的优点底物产物分开；能回收，可反复使用；易于连续化、自动化✧酶固定化的优缺点优点：➢酶固定化的方法（详见课件）➢酶固定化的性质大多数固定化酶活性下降；提高了稳定性；最适温度也随之提高，不变或下降；pH 和pH-活性曲线常常发生偏移（微环境表面电荷性质的影响）；K m变化（高级结构变化及载体影响引起酶与底物亲和力变化，又受溶液中离子强度的影响）固定化酶制备物的性质取决于所用的酶及载体材料的性质。

酶：生物化学性质；动力学参数载体：化学特征；机械性质固定化酶：固定化方法；稳定性等➢细胞的固定化概念：将细胞约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。

固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞。

该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢。

优点：保持了细胞内酶系的原始状态与天然环境，因而更稳定；保持了细胞内原有的多酶系统，适于多步催化的反应；无需辅酶再生；固定化增殖细胞发酵具有显著优越性。

缺点：细胞内有多种酶，可能有副反应；细胞膜等存在扩散限制作用；载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性。

➢固定化细胞的分类，制备方法1. 化学法（共价交联）2. 包埋法3. 吸附法➢固定化酶与固定化细胞的应用：生物化学与分子生物学基础研究/亲和分离系统/药物控释载体/在食品、制药等轻工、化工领域/生物传感器➢生物传感器:又称生物活性物质修饰的传感器➢Lecture 6 酶的修饰（1）➢酶反应器的概念，类型概念:以酶或固定化酶作为催化剂进行酶促反应的装置➢酶的稳定性和稳定化酶（蛋白质）的稳定性是指酶抵抗各种因素的影响，保持其生物活力的能力。