【课题】：课题5 DNA的粗提取与鉴定【主备人】：苗贤举【备课时间】： 3月10日【审核人】：宋利刚【复习目标】本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质，理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。

【复习重点与难点】复习重点：DNA的粗提取和鉴定方法。

复习难点：DNA的粗提取和鉴定方法。

【知识回顾】一、实验原理1、提取DNA的方法提取生物大分子的基本思路是。

对于DNA的粗提取而言，就是要利用、等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。

1）DNA的溶解性思考题1：DNA在氯化钠溶液中的溶解度有什么特点？对此有什么应用？思考题2：利用什么原理来将DNA与蛋白质分离开？2）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解，但是对没有影响。

大多数蛋白质不能忍受60—80o C的高温，而DNA在以上才会变性。

洗涤剂能够瓦解，但对DNA没有影响。

3）DNA的鉴定思考题3：依据什么原理来鉴定DNA？在条件下，DNA遇会被染成色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA 的试剂。

二、实验设计1、实验材料的选取凡是含有的生物材料都可以考虑，但是使用的生物组织，成功的可能性更大。

在下面的生物材料中选取适合的实验材料：鱼卵、猪肝、菜花（花椰菜）、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基的大肠杆菌2、破碎细胞，获取含DNA的滤液1）制备和提取细胞核物质：动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例。

在鸡血细胞液中加入一定量的，同时用搅拌，得到鸡血细胞液。

过滤后收集研磨液；如果实验材料是植物细胞，需要先用溶解细胞膜。

例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的和，进行充分的搅拌和研磨。

过滤后收集研磨液。

思考：①为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？②加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？③如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响?④此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？2）溶解细胞核的DNA：向收集的滤液中加入的溶液，搅拌使DNA呈溶解状态。

3、去除滤液中的杂质方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。

思考：①为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？②方案二与方案三的原理有什么不同？4、DNA的析出与鉴定将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积、冷却的，静置，溶液中会出现，这就是粗提取的DNA。

用玻璃棒搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。

取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。

然后，向两支试管中各加入4ml的。

混合均匀后，将试管置于中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变。

三、实验案例：以鸡血细胞DNA的提取和鉴定为例：1．制备鸡血细胞液：在鸡血中加入质量浓度为0．1g/mL的柠檬酸钠溶液，离心处理；2．提取鸡血细胞的细胞核物质：向鸡血细胞液中加入蒸馏水，搅拌、过滤；思考1：加入蒸馏水的目的是什么？为什么能达到此目的？3．溶解细胞核内的DNA：加入2mol/L的氯化钠溶液，搅拌，使DNA呈溶解状态；4．析出含DNA的黏稠物：加入蒸馏水，用玻璃棒搅拌；思考题2：此时加入蒸馏水的目的是什么？5．滤取含DNA的黏稠物：过滤；思考题3：这次过滤与上次过滤的目的一样吗？为什么？6．将DNA的黏稠物再溶解：加入2mol/L的氯化钠溶液，搅拌，使DNA呈溶解状态；7．过滤含有DNA的氯化钠溶液：过滤；思考题4：这一步骤的目的是什么？思考题5：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？8．提取含杂质较少的DNA：加入冷却的95%的酒精，搅拌；思考题6：这一步骤的目的是什么？思考题7：为什么加入的酒精需要冷却的？9．DNA的鉴定：取两支试管，各加入0．015mol/L的氯化钠溶液5mL，一支加入提取的DNA，两支各加入4mL的二苯胺试剂。

混合均匀后置于沸水中加热。

四、操作提示1、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g ，防止。

2、加入洗涤剂后，动作要、，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。

加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要，以免，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。

3、二苯胺试剂要，否则会影响鉴定的效果。

4．DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系：当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，随浓度的升高，DNA的溶解度降低；当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时，随浓度升高，DNA的溶解度升高。

5．盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。

鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。

因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的DNA的损失。

[典例解析]本实验中有三次过滤：⑴过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液⑵过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液⑶过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液以上三次过滤分别为了获得（）A含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液B含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、含DNA的滤液C含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、纱布上的DNAD含较纯的DNA滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液答案：A解析:用蒸馏水稀释鸡血细胞液，使血细胞的细胞膜、核膜破裂，释放出核物质，此时过滤只能得到含DNA和其他物质如蛋白质的滤液，这种滤液必须经过实验中其他步骤得相继处理，方能得到较纯的DNA。

DNA在0.13mol/LNaCl溶液中溶解度最低，成丝状粘稠物，可经过滤留在纱布上。

【习题巩固】一、选择题（10个）1.在研究DNA的基因样本前，采集来的血样需要蛋白水解酶处理，然后用有机溶剂除去蛋白质。

用蛋白水解酶处理血样的目的是（）A.除去血浆中的蛋白质B.除去染色体上的蛋白质C.除去血细胞表面的蛋白质D.除去血细胞中的所有的蛋白质，使DNA释放，便于进一步提纯2．与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是（）A.操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度B.在操作A时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子完整C.加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度，两者均可析出D.当丝状粘稠物不再增加时，此时NaCl的浓度相当于0.14mol/L3．洗涤剂能够瓦解（），但对DNA没有影响。

A.细胞壁B.细胞膜C.细胞核D.细胞质4．在沸水浴的条件下，DNA遇（）会被染成蓝色。

A.斐林试剂B.苏丹Ⅲ染液C.双缩脲试剂D.二苯胺5．在DNA提取过程中，最好使用塑料试管和烧杯，目的是（）A.不易破碎B.减少提取过程中DNA的损失C.增加DNA的含量D.容易洗刷6．下列操作中，对DNA的提取量影响最小的是（）A.使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，放出DNA等核物质B.搅拌时，要使用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌C.在“析出DNA粘稠物”时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中粘稠物不再增加D.在用酒精沉淀DNA时，要使用冷酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却E在DNA的溶解和再溶解时，要充分搅拌7．DNA的粗提取中，将与滤液体积相等的、冷却的（），静置2—3min，溶液中会出现白色丝状物。

A.0．9%的NaClB.0.14mol/L的NaCl溶液C.质量分数15%的HClD.体积分数为95%的酒精溶液8.以血液为实验材料时，需要向血液中加入（），防止血液凝固。

A.醋酸钠B.龙胆紫C.柠檬酸钠D.醋酸洋红9.在向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（）A.加快溶解DNA的速度B.加快溶解杂质的速度C.减少DNA的溶解度，加快DNA析出D.减小杂质的溶解度，加快杂质的析出10.去除滤液中的杂质时，直接在滤液中加入嫩肉粉，利用嫩肉粉中的（）分解蛋白质。

A.胃蛋白酶B.胰蛋白酶C.木瓜蛋白酶D.肠肽酶二、非选择题（3个）1．提取鸡血中DNA时，要除去血液中的上清液，这是因为什么？2．填写本实验完成下列实验操作时所用试剂。

⑴提取鸡血细胞中核物质⑵溶解核内DNA：⑶析出2mol/LNaCl溶液中的DNA⑷DNA粘稠物的再溶解⑸提取杂质较少的DNA白色乳状丝状物⑹DNA的鉴定3.关于DNA粗提取的实验材料的选择，也经过了多次实验效果的比较，最终选择鸡血做实验材料的原因是什么？请回答下列问题：⑴鸡血细胞中红细胞，家鸡属于鸟类，新陈代谢旺盛，因而血液中细胞树木较多，可以提供丰富的。

⑵实验前由老师制备血细胞液供同学们做实验材料，而不用鸡全血，主要原因是。

⑶生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，若他们按实验要求完成实验步骤后，结果是，这是因为这些动物和人一样，成熟的红细胞中，但若改用动物肝脏做实验材料，实验能顺利进行。

这是因为。

⑷若选用动物肝脏做实验材料，在提取之前，最好增加程序，使组织细胞更易分离。

【疑难点拨】1．为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。

2．加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。

3．如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。

4．此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。

5．为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。

因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。

6．方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。

7.DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系：当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，随浓度的升高，DNA的溶解度降低；当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L 时，随浓度升高，DNA的溶解度升高。

8.制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入柠檬酸钠的原因制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入抗凝剂——柠檬酸钠，防止血液凝固。

其原理是柠檬酸钠能与血浆中Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液便不会凝固，因为鸡血红细胞，白细胞都有细胞核，DNA主要存在于细胞核中，所以在离心或静置沉淀后，要弃出上层清液——血浆。