产蛋白酶K毕赤酵母重组菌株高密度发酵及酶学性质分析姓名：李善军学号：2015304120225院系：华中农业大学生科院摘要蛋白酶 K 具有极高的酶活性和广泛的底物特异性, 在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K 都有着重要的应用。
毕赤酵母是近十几年来发展起来的真核表达体系，将蛋白酶 K在毕赤酵母中重组表达将是突破其高效表达的一个重要步骤。
本实验利用产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌进行高密度的液体发酵，掌握毕赤酵母菌全自动液体发酵工艺，同时对的到产物酶酶学性质进行分析。
经实验结果得知，毕赤酵母基因工程菌发酵最高密度达到湿重283.97g/L，得到的蛋白酶K最大酶活为29000U，蛋白酶K的分子质量为31ku,最适温度为65度，最适PH为8，Na+、K+、Ca+和Mg+对蛋白酶K酶活有促进作用，而Ni+和Zn+对酶活反应则是抑制作用。
关键词：蛋白酶K、毕赤酵母菌、高密度发酵、酶学分析本实验的蛋白酶 K 属丝氨酸蛋白酶类，它是林伯氏白色念球产生的一类主要蛋白酶。
因能合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白为唯一碳氮源的环境中生长，故将其称作蛋白酶 K。
蛋白酶 K 具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，能优先分与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸 C 末端邻接的酯键和肽键，常被用于降解蛋白生产短肽。
利用其这个特性，在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K 都有着重要的应用。
由于林伯氏白色念球菌生长缓慢难以达到高密度培养的目标，而且菌体在产生蛋白酶 K 的同时还会分泌表达其他蛋白酶，加之对林伯氏白色念球菌的基因操作比大肠杆菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌等常用基因工程菌困难许多，这些都给蛋白酶K的高效大规模生产带来困难。
毕赤酵母是近十年来发展起来的真核表达体系,它的生长环境除了包括十分环保而廉价的无机盐，微量元素和必须的碳氮源外，还要添加生物素，甲醇能够作为它的唯一碳源保证其生长。
将蛋白酶 K在毕赤酵母中重组表达将是突破其高效表达的一个重要步骤。
本实验对产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌高密度液体发酵工艺进行探讨，并对产物酶蛋白酶K的酶学性质进行分析，使对产蛋白酶K 的毕赤酵母基因工程菌及其产物有一个较为深刻的理解。
1、产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌高密度液体发酵1.1种子液培养1.1.1种子培养基YPD培养基：酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%（琼脂1.5%）YPG培养基：酵母粉1%、蛋白胨2%、甘油2%1.1.2培养温度与菌龄挑取YPD平板上的单菌落（生科院发酵实验室）到8瓶100/500 mLYPG 培养基中，30℃，250 r/min 摇床培养28h。
1.2发酵罐培养1.2.1菌体培养清洗干净发酵罐，校正pH、DO电极后插入发酵罐，加入20LBSM（配方见下表）无机盐培养基，115℃20min 灭菌，完成后冷却至30℃。
通过补料泵调节pH 值为 5.0，按4%的接种量接种种子液，并加入头孢1g ，PTM1为微量盐87ml （4.35ml/L 发酵液），通气搅拌发酵。
甘油分批阶段完成时,碳源耗尽，DO 急剧上升，时间为24h 。
此时开始补加50%甘油进入甘油补料阶段，时间为6h 。
BSM:1.2.2甲醇诱导开始进行碳源饥饿0.5h ，开始补加甲醇进入甲醇诱导产酶阶段。
同时注意温度保持在30度，罐内压0.05MP,转速500r/min,控制甲醇的流速，每6个小时取样，测量菌体生物量。
2、酶学性质鉴定2.1 酪氨酸标准曲线的制作准确称取干燥的酪氨酸，配置0、20、30、40、40、50、60、70、80ug/ml 的酪氨酸溶液。
用试管分别吸取不同浓度的酪氨酸1ml ，各加入0.4ml 的碳酸钠5ml ，再加入已稀释的福林试剂1ml ，摇匀放入水浴锅中。
40度保温发色20min ，在分光光度计进行测定（660nm ），测3次，取平均值。
将各浓度的酪氨酸测得OD 值减去0ug/ml 的酪氨酸OD 值得到净OD 值，制作标准曲线如下图1：2.2 确定反应最适ph配制50 mmol/L pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0、pH 9.0、pH 10.0、pH 11.0、pH 12.0、pH 13.0 的缓冲液。
取1 mL不同pH稀释合适倍数的粗酶液，加入1 mL 用相同pH 缓冲液配制的底物，混匀，65℃反应10 min。
以OD660最高的酶活为100%，计算不同pH 条件下的相对酶活。
2.3 确定反应最适温度1)配制合适的ph缓冲液，将粗酶液稀释合适的倍数（根据前面的实验得到最适ph）。
2)取稀释好的酶液1 mL，加入1 mL 2%的酪蛋白底物，分别在20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，65℃，70℃，80℃中反应10 min，再加入2 mL TCA溶液终止反应，再保温20 min；3)12000 r/min离心2 min。
取上清1 mL，加入5 mL Na2CO3和1 mL稀释的福林试剂，40℃保温20 min。
4)取 3 mL加到石英比色皿中，紫外可见分光光度计测定OD660，以OD660最高的酶活为100%，计算不同温度条件下的相对酶活。
2.4 酶活检测取试管2支，编号1,2，每管内加入样品（各个样品都需要做）稀释液（根据前面实验得到最佳ph进行缓冲）1mL，置于65℃（得到最佳反应温度）水浴中预热2min，再各加入经同样预热的2%酪蛋白（缓冲液配制） 1mL，精确保温10min，时间到后，立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL，以终止反应，继续置于水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤。
然后另取试管2支，编号l, 2，每管内加入滤液1mL，再加0.4mol碳酸钠5mL，已稀释的福林试剂1mL 摇匀，40℃保温发色20min后进行光密度(OD)测定。
将实验组OD值减去对照组OD值得到净OD值。
将得到净OD值带入公式：样品蛋白酶活力单位=A/10*4*N式中：A—由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数（或OD值）；4—4毫升反应液取出1ml测定（即4倍）；N—酶液稀释的倍数；10—反应时间10min。
一个单位酶活（U）定义为：在65℃下每分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸所需要的酶量2.4 金属离子对蛋白酶活性的影响根据最适pH和2%的酪蛋白底物配制反应体系，并分别添加钠、钾、钙、镁、锌、镍的金属离子盐，使反应体系中金属离子终浓度分别为1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L，在最适条件下测定蛋白酶活性2.5 SDS-PAGE电泳测取发酵54h、60h、66h、84、90h和96h粗酶液，加入少量溴酚蓝溶液进行点样，同时有标准酶作为对照。
电泳条件：点样：沸水浴5 min，点样量10ul （不稀释）预跑：30v，5min压缩胶：80V, 30min；分离胶：160V，直至溴酚蓝跑出胶的底部3、结果与分析3.1反应最适ph测定将产物酶在不同ph缓冲液中反应，结果如图2所示：图2蛋白酶K最适反应ph从结果可以看出，产物酶在ph8和10时活性最高，在ph7-11之间，酶的活性能达到80%以上，低于ph7或高于ph11时，酶活性快速下降。
3.2反应最适温度将得到的产物酶置于40、50、60、65、70、80度下进行反应，所测的相对酶活结果如图3;图3蛋白酶K最适反应温度从上图可以看出，蛋白酶最适反应温度为65度，在60-70度之间蛋白酶K都有着很高的活性，但到80度是，酶活性急剧下降，下降了约90%。
3.3 毕赤酵母基因工程菌发酵生物量与产物酶酶活测得毕赤酵母基因工程菌在不同发酵时间时的生物量及所在时间产物酶的活性大小结果如图4；生物量(g /L )酶活U从上图可知，在36h 之前毕赤基因工程菌保持生殖生长阶段，工程菌数量快速增长，在此阶段重组酶基因极少表达，重组酶极少。
36h 之后，工程菌数量进入稳定期，菌株开始表达次级代谢产物，酶活也不断增加。
3.4 粗酶液的SDS-PAGE 电泳图4工程菌生物量与产物酶酶活图5 蛋白酶K的SDS-PAGE分析SDS-PAGE电泳结果表明表达产物的分子质量约为31ku，随着时间的推移目标蛋白表达量趋于稳定。
3.5 金属离子对酶活反应的影响将粗酶液放置于不同浓度的金属离子溶液中进行反应，得到的结果如下图所示。
从结果可知，钠离子、钾离子、钙离子和镁离子对酶活反应有促进作用，只有在一定浓度范围内促进作用明显，低于或超过浓度，促进作用会下降。
而镍离子和锌离子对反应有抑制作用，且浓度越高抑制越明显。
4、讨论本实验利用毕赤酵母菌株对蛋白酶K进行重组表达，并通过研究高密度液体发酵和酶学性质得到了其最优的培养条件和酶活性发挥的最佳条件。
从结果可知，在发酵时间在96h时，生物量能达到282g/ml，说明了毕赤酵母菌在高密度发酵有着很大发展空间。
本实验对得到的蛋白酶K进行了一些列的性质测定，包括最适ph、反应温度、金属离子对其影响。
分析发现，重组蛋白酶K最适温度是65度，但是该酶对温度要求并不苛刻，在30度-70度的范围内都有酶活性，并能保持在相对酶活在70%以上，这更好的证明了为什么这种重组蛋白酶K会有更广阔的应用前景。
本实验同样还有一些工作有待完善和改进。
本实验优化了一些毕赤酵母基因工程菌高密度液体发酵的参数，在一定程度上能提高表达量和酶活，但结果并没达到令人满意的结果，可以继续通过优化菌株和发酵罐发酵条件来优化表达条件，提高蛋白酶K的表达量。
5、参考文献黄君，张昌毅，赵述淼，梁运祥.黑曲霉内切_1_4_葡聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达.华中农业大学，2008，27（5）：611-615.吴彤.在毕赤酵母中高效表达重组蛋白酶 K.[硕士论文]，齐鲁工业大学，2013. 隋少飞，陈松林.巴氏毕赤酵母表达系统的特点及其研究进展.生物技术通报，2004，3：1-4.韩雪清，刘相涛.毕赤酵母表达系统.微生物杂志，2003，23（4）：35-40.孙风敏.密码子优化的蛋白酶K在毕赤酵母中的表达及分离纯化.[硕士论文]，大连理工大学，2014.。