生物技术通讯LETTERSINBIOTECHNOLOGYVol.24No.1Jan.,2013
毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展夏姗1,2，武福军2,3，赵洪亮2，薛冲2，刘志敏21.安徽大学生命科学学院，安徽合肥230039；2.军事医学科学院生物工程研究所，北京100071；
3.山西康宝生物制品股份有限公司，山西长治046000
［摘要］近年来毕赤酵母已成为一种优越的异源蛋白表达系统。而提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵已成为关键技术环节之一。我们从毕赤酵母工程菌的选择、培养基的优化设计，以及发酵工程过程控制等方面简要阐述毕赤酵母的高密度发酵，并提出了工程菌在高密度发酵过程中存在的问题。［关键词］毕赤酵母工程菌；高密度发酵；培养基优化；发酵过程控制［中图分类号］Q78［文献标识码］A［文章编号］1009-0002（2013）01-0109-04
ProgessofPichiapastorisEngineeringBacteriaonHigh-DensityFer⁃mentation
XIAShan1,2,WUFu-Jun2,3,ZHAOHong-Liang2,XUEChong2,LIUZhi-Min2*1.SchoolofLifeScience,AnhuiUniservity,Hefei230039;2.BeijingInstituteofBiotechnology,Beijing100850;3.ShanxiKangbaoBiologicalProductCo.Ltd,Changzhi046000;China*Correspondingauthor,E-mail:liuzhm@vip.sina.com
［Abstract］Pichiapastorishasbeenutilizedwidelyasanexcellentheterologousgeneexpressionsystemrecently.High-densityfermentationhasbeenakeytechniquetachetoimprovetheexpressionleveloftheproteinofinter⁃
est.Inthispaper,weexpoundedthechooseofengineeringbacteria,designationandoptimizationofculturemedi⁃um,andcontroloffermentationcoursetoincreaseP.pastorisonhigh-densityfermentation.Moreover,thequestionsexistinginindustryhigh-densityfermentationwereputforward.
［Keywords］Pichiapastoris;high-densityfermentation;optimizationofculturemedium;controloffermentationcourse
综述doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2013.01.02620世纪80年代以来，随着生物技术药物在人类
疾病治疗和预防中的广泛应用，大大加速了微生物细胞表达产品的产业化进程。近20年来，毕赤酵母大规模培养已成为生物制药领域非常重要的关键技术之一，并不断推动生物技术产业的迅速发展。毕赤酵母表达系统在表达外源蛋白方面具有非常明显的优势，这是因为毕赤酵母本身为单细胞真核生物，易于分子遗传学操作，且外源基因可以整合到酵母的染色体上，随染色体一起复制和遗传，不易造成外源基因的丢失现象；具有强诱导性和强启动性的醇氧化酶基因启动子，适用于外源基因的高水平诱导表达；并且毕赤酵母在高水平表达外源蛋白的同时，自身背景蛋白分泌却很少，不需要破菌等复杂操作，有利于后续纯化；毕赤酵母发酵产物的积累不会对自身宿主菌产生大的毒副作用，这更有利于大规模的高密度发酵。目前，越来越多的国内外研究者选择毕赤酵母作为外源蛋白的优先表达系统，表达产物包括干扰素、白介素2、抗体等[1-3]，且已有产品上市。尽管毕赤酵母有自身的优点，但对于不同的具体目标产品，表达水平参差不齐。如胞内分泌表达的巴西三叶胶腈水解酶的产量高达22g/L[4]，破伤风片段C产量高达12g/L[5]，胞外分泌表达的明胶的产量达到14.8g/L[6]等，而最低的报道只有1mg/L，其间相差可达10000倍。因此，要提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵（high-densityfermentation）也成为一个关键技术环节。
1毕赤酵母工程菌的选择和改良
1.1工程菌的选择
目前毕赤酵母工程菌株常常呈现2种表型，分别为mut+和muts，aox1基因缺失的酵母在甲醇限制性培养基上生长缓慢（methanolutilizationslow，muts或mut-
），它们只能利用弱的aox2基因启动合成
收稿日期：2012-08-20基金项目：国家高技术研究发展计划（2009AA02Z108）作者简介：夏姗（1990-），女，硕士研究生通信作者：刘志敏，（E-mail）liuzhm@vip.sina.com
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醇氧化酶（AOX），而aox1基因完整的酵母则生长正常（mut+）。目前这2种表型的毕赤酵母菌株在高密度大规模表达时均有使用，主要根据具体的外源蛋白来选择，如根据表达产物的分子大小、降解产物的多少、蛋白折叠程度等性质选择工程菌的表型。如考虑到后续产品的制备，一般选用无缺陷的mut+菌株，对外源蛋白适用性好，便于发酵控制[7]；如果是胞内表达，应尽量用muts菌株，这样得到的蛋白产物中AOX较少而目的蛋白量相对较多（占毕赤酵母总分泌蛋白量的30%~90%，使下游纯化更易进行[8]）。1.2对重组转化子的筛选为了获得高产量的表达菌株，就需要对大量转化子进行筛选，这就要求人们在考察菌体对表达产物表达水平的同时，也要考虑到该表达系统对表达产物的影响。如果工程菌表达系统中表达产物容易降解或易受培养基成分的影响，需要考虑表达产物是选择分泌表达还是细胞内表达。2培养基的设计和优化目前在毕赤酵母表达外源蛋白的培养过程中，主要使用不同大小的生物反应器，采取补料-分批发酵（fed-batch）工艺，包括基础培养相、流加补料相（进一步提高菌体密度）和诱导表达相的三相发酵，而高密度发酵培养主要是通过基础培养相来实现菌种的生长、增殖，再通过流加补料相进一步使菌体大量增殖与累积，从而达到高密度菌体。2.1基础培养基的选择补料-分批培养中的培养基的组分直接影响细胞的生长和外源基因的表达。在毕赤酵母高密度培养时，培养基主要包括BMGY/BMMY、BMG/BMM和BSM，也有部分使用MGY/MMY培养基。基础盐培养基（BSM）在低pH值条件下处于溶解状态，但在高pH值条件下易产生盐沉淀，所以在生产时一般使用低浓度的盐或优化后的培养基。BMGY/BMMY、BMG/BMM培养基中包含磷酸盐缓冲液，可以维持培养基中的pH值保持相对恒定，适用于对pH值敏感的表达产物的表达，但由于培养基组分和多步操作，在生产中容易引起污染。由于表达产物的特殊性和多样性，在分批培养过程中需要对培养基进行筛选和优化。另外，为了保护目的产物的活性和不被降解，须在培养基中添加蛋白酶抑制剂或EDTA等保护剂，以降低蛋白酶对表达产物的降解[9]。2.2补料培养基的补加方式目前毕赤酵母发酵过程中的补料培养基主要成分为葡萄糖和甘油，含诱导型启动子的菌株一般在甲醇和甘油或甲醇和葡萄糖的培养基中生长[10]；而组成型启动子［如甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因的启动子］则可以不需要甲醇的诱导在含葡萄糖的培养基中正常生长[11]。葡萄糖作为碳源性价比较高，有利于工业化生产；甘油作为毕赤酵母的碳源，效果优于葡萄糖，但其浓度过高和过低均会影响菌体的生长。为了实现菌体高密度发酵的同时又有利于大规模生产，许多研究者对补料方式做了深入细致的研究，主要包括间歇式补料发酵、恒速流加补料发酵、指数流加发酵及在不同时期综合考虑的流加方式[12]。间歇式补料发酵是最常见的流加发酵方式，即每隔一段时间补料一次；恒速流加补料发酵，以恒定流速补加培养基，直到诱导表达开始；指数流加发酵是随微生物生长同步补加的方式，在一定范围内菌体量随时间以指数函数增加，所以流加补料也随时间以指数函数增加，这种流加需要对菌体的生长速率有准确的把握，其生长速率的大小也会影响菌体的生长。Cunha等在研究scFv受体片段的发酵过程中，发现在诱导阶段细胞浓度和甲醇的摄取率是对表达量影响最大的因素[13]。在规模化大生产过程中，补料方式的选择要综合考虑生产成本和菌体增殖，同时要考虑到补料对目的表达产物的影响。目前有研究采用时间分段，各段采用不同的补加方式，既有利于菌体的生长又有利于培养基的完全利用。
3发酵过程控制
目前，对毕赤酵母的高密度发酵培养的过程控制策略呈多样化，比如对影响菌体生长的各个因素的控制、对细胞生长速率的控制、反馈控制和对培养基成分浓度的控制等，但各控制之间关联因素多，无法形成一个合理的模型控制，需要进一步探索。3.1发酵过程参数的控制
3.1.1溶氧的控制对于毕赤酵母而言，发酵培养
中的溶解氧是影响生长表达的关键因素。高密度发酵需要消耗大量氧气，尤其在菌体快速生长期间，供氧往往成为菌体大量生长的限制因素，保证氧气的供给成为高密度发酵的重要因素。培养基中溶解氧的提高主要受通气量、搅拌速度、罐压的直接影响，以及温度、补料速度等的间接影响，因此溶解氧可以反映出菌体生长情况。为了提高溶解氧的浓度，生产上开始采用纯氧和空气按一定比例混合通气的方式来提高供氧能力，尽力解决由于缺氧带来的限制。但是，也有研究表明氧浓度太高会抑制菌体的生长和繁殖[14]。3.1.2温度的控制温度对菌体的生长和发酵的影
响是各种因素综合表现的结果。温度对毕赤酵母发
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