2.在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子 筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质 量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的 迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因 此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA 分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构， 最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两个质粒 连在一起），而不是开环结构 开环结构（用EcoRI来线性化 开环结构 质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA 的位置与这三条带的位置不一样）
4. 酶单位定义：在每种内切酶理想的反应条件下
， 0.05mL反应混合物中, 1小时消化1µg底物 DNA的酶量为1单位(1U)。
三 质粒提取实验材料与试剂
（一）实验材料：
过夜培养大肠杆菌DH-5a （二）实验试剂： LB培养基 0.1M NaCL、10mM Tris.CL（pH8.0）、 1mM EDTA、 Amp 50mg/ml、酚、氯仿、Rnase、琼脂糖 TE：10mM Tris.CL （pH8.0），1mM EDTA 溶菌酶 10mg/ml（用10mM Tris.CL，pH8.0，新鲜配 制）
5. DNA：作为内切酶的底物，DNA应该具备 ： 一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、 乙醚、SDS和酒精等，这些因素的存在均 在不同程度影响限制性内切酶的活性。
反应缓冲液：
1. 反应缓冲液: 主要由Tris-HCl、NaCl、Mg2+ 组成，其中Mg2+ 为内切酶的辅基； A. Tris-HCl维持反应体系的PH值在7.2~7.6之 间； B. NaCl浓度：
碱变性法小量提取质粒 DNA的限制性酶切
厦门大学医学院 分子生物学实验教学组
目的
• 掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法:最常 用的提取基因工程中运载基因的载体 • 掌握质粒酶切鉴定原理, 学会根据目的基 因和实验目的选择合适载体与限制性内切 酶，设计构建体外重组分子
• 质粒(plasmid)是染色体外能够进行自主复 制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和 细菌细胞中染色体以外的DNA分子，在基因 工程中质粒常被用做基因的载体。
• 9. 倒去上清，加入1ml冰预冷70%乙醇振荡漂洗 DNA沉淀。12000 rpm，4 ℃离心2分钟。 • 10．弃上清并尽量吸除液体，打开管盖，室温放 置5min。室温放置15min干燥。 • 11．50μL TE缓冲液（含无DNase的RNase 20 µg/ml） ，使DNA完全溶解（-20℃保存） • 12．取样品10 µl加2ul 6× Loading buffer于1 %琼脂糖电泳，电泳凝胶在凝胶成像系统上成像。
3. 溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核 酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙 色荧光
原理示意图
• 限制性核酸内切酶: 限制性核酸内切酶:
一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解 酶。 限制性切酶以内切的方式水解核酸链中的磷酸二 酯键，产生的DNA片段5’端带磷酸基团，3’端 为-OH。
四步骤(一) 细菌培养与质粒扩增
1. 挑单克隆E.coli菌株接种到4ml LB培养液中 （含Amp 50µg/ml），37 ℃225rpm振荡培养过夜。 （活化菌种） 2.从中取2ml种子菌液于含Amp培养基500ml中， 37℃振荡培养3-4小时（OD600＝1.0） 3.取4ml培养液至Eppendorf管中，12000 rpm，4 ℃离心30秒，弃上清，用1ml STE悬浮菌体，再离 心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀。
5.加入150μL溶液III （冰上预冷），盖紧管口，颠 倒数次使混匀，冰上放置5min。 6.12000r/min， 4 ℃离心5min，将上清夜转至另一 1.5ml Eppendorf管中。 7.加入等体积酚/氯仿（1：1），振荡混匀，室温放 置5-10min，12000 rpm，4 ℃下离心2分钟，倒去 上清，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加入2倍体积冰预冷无水乙醇，振荡混匀，12000 rpm 4 ℃离心5分钟。
步骤二 质粒提取
1. 取4ml培养物至Eppendorf管中，12000rpm，4℃， 离心30sec，弃上清。 2. 用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复 一次，弃上清取沉淀，使细胞沉淀尽可能干燥。 3. 将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中，加入 10 µl溶菌酶（10mg/ml），剧烈振荡均匀，冰 上放置1分钟。 4. 加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf 管，快速轻柔颠倒5次，混匀内容物，将 Eppendorf管放在冰上3分钟 。
Hale Waihona Puke 七．思考题1.要得到高质量质粒样品，用碱变性法小量提取质 粒时要注意什么事项？ 2.溶液I、溶液II和溶液III的作用是什么？在实验 中分别加入上述溶液后反应体系出现的现象及其 成因是什么？ 3.酚氯仿抽提时DNA溶液体系出现什么现象？为什么？ 4.沉淀DNA时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条 件下进行？
凝胶成像结果
1.2% Agarose Gel
1 2 3 4
1.1000bp DNA ladder 2. CDNA3-p38/EcoRI+XbaI 3. ppCDNA3-p38 4.100bp DNA ladder
六．注意事项
为提高质粒产量，要注意下面步骤： • 加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬 浮； • 加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒5-10次) ，使蛋白 质和核酸变性； • 加溶液III后PH要达到中性(轻柔振荡5-10次 )，使质 粒DNA复性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开， 否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。 • 加入乙醇沉淀DNA时，要把离心管盖上盖子倒翻摇动几 次，注意观察水相和乙醇之间没有分层现象之后，才 可以放到冰箱中去沉淀DNA。
• 选择哪一种方法主要取决于以下几个因素： 质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于 纯化的技术和实验要求
碱裂解法
基本原理： 1. 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋 白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质 粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离 心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复 性而呈絮状，离心时可沉淀下来
限制性核酸内切酶分类
• 识别切割特性 • 催化条件 • 是否具有修饰酶活性
• 至2005年1月，共发现限制酶3681种
–Ⅰ 型59种 –Ⅱ 型3612种 –Ⅲ 型10种
• 商业化的限制酶有 588 种，在 Ⅱ 型限制 酶中共有 221 种特异性。
Ⅱ型限制与修饰系统
• 占90%以上，即通常指的DNA限制性内切酶，它们 能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行 切割，产生特异的DNA片段； • Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅 助因子，识别顺序一般为4-6个碱基对的反转重复 顺序； • Ⅱ型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口：5’ 端突出，3’端突出和平末端。
5. 在整个酶切反应过程中应注意哪些问题？
6. 如何选择DNA和限制性内切酶的用量？
7. 反应体系中为何内切酶用量不能超过整个 反应体系的10%？
注意
• EB是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应 带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该 染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的 器皿或物品，必须进行清洗或弃去
双酶切实验材料
• 限制性内切酶：EcoRⅠ、XbaⅠ和HindⅢ • DNA：λDNA和质粒pCDNA-p38 • 10×buffer H （37℃, PH7.5）
90mM Tris•Cl 50mM NaCl 10M MgCl2
• 10×buffer M（37℃, PH7.5）
6mM Tris•Cl 100mM NaCl 6M MgCl2
• 溶液Ⅰ—溶菌液： 50mM 葡萄糖，25mM Tris.Cl（pH8.0），10mM EDTA， 2mg/ml 溶菌酶。
• 溶液Ⅱ— NaOH-SDS液：0.2N NaOH，1% SDS。
• 溶液Ⅲ— 3mol/L NaAc（pH4.8）溶液：5M KAC 10ml，冰醋酸 11.5ml，水 28.5ml。
• 1mM DTT • 10×BSA： 1mg/ml • 无菌水
方法和步骤
反应体系配制： 1. 反应体系配制：
质粒pCDNA3－p38 10×buffer M 10×BSA EcoRⅠ XbaⅠ H2O 总体积 10 µl（1µg） 2 µl 2 µl 1 µl 1 µl 4 µl 20 µl
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2. 将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离 心收集液体。 3. Eppendorf管于37℃水浴中反应2~3小时。 4. 反应结束后70℃灭活15min或者加入EDTA至终浓 度10mM终止反应。 5. 取20µl反应液加入6×loading buffer混匀于1.2 ％琼脂糖凝胶胶上150伏电泳，约30min 加入5µl 未酶切对照。 6. 凝胶成像体系观察记录结果。 7.当DNA条带充分分开后，在紫外灯下细心切取所要 的DNA条带。尽量去除多余的凝胶。紫外灯照射 DNA片段不要超过30秒。注意保护眼睛免受紫外线 伤害。
低盐(10mM NaCl) 中盐(50mM NaCl) 高盐(100mM NaCl)
2. 酶解的温度：大多数限制酶的反应时间为37℃
，如EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ等，也 有如BclⅠ需在50℃下进行反应。
3. 酶解反应时间：根据酶的单位与DNA用量之比
来定，原则是酶/DNA＝2~3，12小时即可充分 酶解。
五 实验结果
• 双链DNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸稀释 倍数×50/1000。