湖北当阳一中沈满弟限制性内切酶分析法是利用限制性
内切酶和特异性DNA 探针来检测是否存在基因变异。

当待测DNA 序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。

如：（2005 湖北3）镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生
了改变。

检测这种碱基序列改变必须使用的酶是 A.解旋酶B.DNA 连接酶C.限制性内切酶D.RNA 聚合酶解析：根据碱基互补配对原则可采用DNA 分子杂交原理或DNA 探针的方法。

采用加热等一定的技术手段将患者的DNA 分子片段与正常人的DNA 分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链。

解旋酶的作用是DNA 分子在复制或转录时将DNA 双链解开，在本题中加热也可以解开达到目的，所以不是必须的酶；DNA 连接酶和限制性内切酶都是基因工程的工具酶，一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA 分子的基本骨架上脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键，DNA 连接酶的作用和它正好相反，是将限制酶切开的缺口缝合起来。

而RNA 聚合酶则是在基因转录过程中促进核糖核苷酸形成mRNA 分子的酶，本题就是采用限制性内切酶分析法解题的。

必须使用的酶就是限制性内切酶，故选C。

根据DNA 分
子杂交原理知，将患者的DNA 分子片段与正常人的DNA 分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链，有无双链便是区别，为什么又要用限制性内切酶将其切开再杂交呢？回答这个问题我们先看看。

2008 天津30-Ⅰ下图为人β -珠蛋白基因与其mRNA 杂交的示意图，①-⑦表示基因的不同功能区。

从本题看出基因的单链的编码区与其转录的成熟的mRNA 之间可以杂交形成杂合链，但是它们两者之间不仅不是完全互补，相反有两个内含子对应的单链部分——③⑤所含有的上百个核苷酸，mRNA 根本没有对应互补的部分，这就说明它们之间相差很大也能够杂交，只不过结果有突起部分而已，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因只有一个碱基发生突变，难道用正常基因转录的mRNA 就不能与只突变一个碱基的基因杂交形成杂合链吗？应该是肯定可以,如果这样来检测，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因的检测结果是相同的，就找不到区别，无法鉴别。

所以必须采用限制性内切酶分析法来检测才有效，具体是先找到一种限制性内切酶，切开控制镰刀型细胞贫血症基因的对应部位的正常基因，这样就形成两短段，也同同一种酶来切镰刀型细胞贫血症基因，因为镰刀型细胞贫血症基因发生了一个碱基的突变，这样相同的
限制性内切酶就无法切开，就还是完整的一长段，在用以上
三段对应的已标记的mRNA 进行杂交（此过程可以不用任何酶，通过控制温度来打开氢键和连结氢键），然后电泳，如果出现两短段的则是正常基因，如果只出现一长段则是突变基因，如果都有的说明两者都存在，可视为杂合。

利用相关知识点命题的请看如下高考试题。

〔2007江苏·38〕单基因遗传病可以通过核酸杂交技术进行早期诊断。

镰刀型细胞贫血症是一种在地中海地区发病率较高的单基因遗传病。

已知红细胞正常个体的基因型为BB、Bb，镰刀型细胞贫血症患者的基因型为bb。

有一对夫妇被检测出均为该致病基因的携带者，为了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都进行产前诊断。

下图为其产前核酸分子杂交诊断和结果示
意图。

(1)从图中可见，该基因突变是由于碱基对改变(或A 变成T) 引起的。

巧合的是，这个位点的突变使得原来正常基因的限制酶切割位点丢失。

正常基因该区域上有3个酶切位点，突变基因上只有2个酶切位点，经限制酶切割后，凝胶电泳分离酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱，正常基因显示 2 条，突变基因显示 1 条。

(2)DNA或RNA分子探针要用放射性同位素(或荧光分子等) 等标记。

利用核酸分子杂交原理，根据图中突变基因的核苷酸序列(…ACGTGTT…)，写出作为探针的核糖核苷酸序列…UGCACAA… 。

(3)根据凝胶电泳带谱分析可以确定胎儿是否会患有镰刀型细胞贫血症。

这对夫妇4次妊娠的胎
儿Ⅱ-l～II-4中基因型BB的个体是Ⅱ一l和Ⅱ一4 ，Bb的个体是Ⅱ一3 ，bb的个体是Ⅱ一2 。

解析:比较基因B 和和突变后的基因b 的碱基组成，发现它们的差别仅是B 基因一条链某一位点上的碱基A 突变成b 基因一条链某一位点上的碱基T（实质上对应的另一条链上的碱基也发生了改变）。

据图观察，正常基因B 经限制酶切割后，凝胶电泳分裂酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱都是二条，而突变后的基因b 经限制酶切割后，与探针杂交后可显示出不同的带谱都是一条。

所以，在分析推断胎儿Ⅱ-1～Ⅱ-4 的基因型时，可以这样认为：基因型Bb 的个体同时带有B 基因和b 基因，所以其应同时含有与B 基因对应的二条带谱，与b 基因对应的一条带谱（这也可以从Ⅰ-1 和Ⅰ-2 得到验证）。

符合这个条件的仅有Ⅱ-3。

同理，基因型为BB 的个体应仅有与B 基因相对应的二条带谱，符合条件的是Ⅱ-1 和Ⅱ-4。

bb 的个体是只能是含有与 b 基因相对应的一条带谱，为Ⅱ-2。

作为探针的必要条件之一是要易于识别，所以可用放射性同位素或荧光分子等进行标记。

既可以用脱氧核苷酸链作探针，也可以用核糖核苷酸链作探针，题干中明确要求用核糖核苷酸链，所以，特别要注意当DNA 链上的碱基是A 时，作探针用的RNA 链上的碱基应为U。

通过如上分析可知，限制性内切酶分析法是利用限制性内切酶和特异性DNA 探针来检测的方法，即是酶切和核酸分子杂交两
种技术的综合分析方法。

核酸分子杂交技术在体外进行的时候可以不用相关酶，但是限制性内切酶无法用温度等外界环境的控制来代替。

限制性内切酶分析法现在的使用很广泛，如：在柯萨奇 B 组病毒B1-B6 型检测及分型中的应用---- 利用GCG 软件对柯萨奇B1-B6 型病毒cDNA 全序列进行了限制性内切酶酶切位点的分析，目前从理论上推测该方法几乎可以检测所有遗传病的变异基因，近几年高考试题也是屡屡出现, 所以特别提醒广大师生在高考复习备考过程中应多加重视。

---ACGT ．GTT--- ---ACGAGTT--- 正常的血红蛋白基因B 突变的血红蛋白基因b 图注:↑限制酶酶切点·突变碱基探针杂交区域带谱I II 1 1 2 2 3 4 凝胶电泳分离酶切片与探针杂交显示的带谱。