本科生实验报告实验课程学院名称专业名称学生姓名学生学号指导教师实验地点实验成绩二〇一五年月二〇一五年月实验一氨基酸的分离鉴定----纸层析法一、实验目的通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及实验方法。

二、实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。

滤纸纤维上的羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。

纸层析法是根据不同氨基酸在两相间的分配比不同而进行分离的：在固定相分配的比例大的氨基酸，随流动相移动的速度慢，而在流动相分配的比例大的则随流动相流动的速度快。

层析溶剂由有机溶剂和谁组成。

物质被分离后用比移值（Rf值）来衡量各组分的分离情况，如图所示。

根据图得到：Rf=a\b其中：a为原点到层析点中心的距离（cm），b为原点到溶剂前沿的距离（cm）。

在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。

Rf值最大等于1，即该组分随溶剂一起上升，Rf值最小等于0，即该组分基本上留在原点不动。

Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和温度等因素有关。

本实验利用纸层析法分离氨基酸。

三、实验药品、实验器材1.扩展剂：将20mL正丁醇和5mL冰醋酸放入分液漏斗中，与15mL水混合，充分震荡，静置数分层后，放出下层水相。

取分液漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中作为平衡溶剂，其余的倒入杯中备用。

2.氨基酸溶液：赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各组分浓度均为0.5%），各5mL。

3.显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。

4.层析缸：毛细管，喷雾剂，培养皿，层析滤纸，分液漏斗，针，线。

四、实验方法1.将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中，使展开剂达到饱和。

2.取层析滤纸（长22cm，宽14cm）一张。

在纸的一端距边缘2cm处用铅笔画一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号。

3.点样：用毛细管将氨基酸样品分别点在这6个位置上，吹干后再点一次。

注意没点再纸上扩散的直径最大不超过3mm。

4.扩展：用线将滤纸沿长边缝成筒状，纸的两边不能接触。

将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中。

点样的一端在下，滤纸下端侵入扩展剂0.5cm为宜，并且注意扩展剂的页面需低于点样线1cm。

待溶剂上升15~20cm时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界限，自然干燥或用热风吹干。

5.显色：层析滤纸用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液；然后置烘箱中烘烤5min（100）或用热风吹干即可先出各层析斑点。

6.计算各种氨基酸的Rf值。

7.注意事项：实验过程应带带胶手套，不可用手直接接触滤纸，以防止皮肤分泌物的污染。

五、实验记录与数据处理实验二蛋白质及氨基酸的呈色反应一、呈色反应蛋白质的呈色反应是由于蛋白质中某些氨基酸特殊集团与一定的化学试剂作用而呈现的各种颜色反应。

呈色反应不是蛋白质的专一反应。

蛋白质的呈色反应可作为检查蛋白质是否存在的参考。

由于不同的蛋白质中，氨基酸的种类及含量各不相同，而在某些蛋白质中还可能缺乏某种颜色反应的氨基酸，因此不但不同的蛋白质呈色反应的强度各不相同，而且有些呈色反应，某种蛋白质中可能不存在。

二、实验目的1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要链接方式。

2、了解蛋白质的某些氨基酸的呈色反应原理。

3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。

三、双缩脲反应（一）实验原理将尿素加热至180度左右，生成双缩脲并放出一分子氨。

双缩脲在浓碱液中能与Cu2+ 结合生成紫色或者紫红色化合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。

凡含有两个肽键（-CO-NH-)以上的化合物都有双缩脲反应，蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。

双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有，除肽键外，有些基团如含有一个肽键和一个-CS-NH2或-CH2-NH2或-CRH-NH2或-CH2-NH-CHNH2-CH2OH或-CHOHCH2NH2等基团的物质以及乙二酰二胺等物质也有此反应。

NH3也干扰此反应，因NH3与Cu2+生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+干扰此反应。

因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。

(二）实验药品①尿素②10%氢氧化钠溶液③1%硫酸铜溶液 ④2%卵清蛋白溶液 （三）实验方法1，取少量尿素结晶，放在干燥试管中。

用微火加热使尿素熔化。

熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。

冷却后，加10% NaOH 约1ml ，振荡混匀，再加1% 硫酸铜 1滴，再振荡。

观察出现的粉红颜色。

避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。

,2，向另一试管加卵清蛋白溶液约 1ml 和10% NaOH 约2ml ，摇匀，再加1% 硫酸铜 2滴，随加随摇。

观察紫玫瑰色的出现。

四、茚三酮反应(一）实验原理凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质，多肽，各种氨基酸（除脯氨酸，羟脯氨酸与茚三酮反应产生的黄色物质外）和伯胺化合物（包括氨）与茚三酮共热时，都能生成紫色化合物，这种反应称为茚三酮反应。

所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。

该反应十分灵敏，1∶1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。

茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。

反应机理如下：（二）实验药品1,、蛋白质溶液2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9） 2、0.5%甘氨酸溶液3、0.1%茚三酮水溶液4、0.1%茚三酮-乙醇溶液（三）实验方法1、取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1~2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。

2、在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。

（四）实验记录五、黄色反应（一）实验原理含有苯环结构的氨基酸，如络氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。

反应式如下：苯酚硝基酚（黄色）邻硝醌酸钠（橙黄色）多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以都会发生黄色反应。

苯丙氨酸不易硝化，需加少量浓硫酸后才能够发生黄色反应。

（二）实验药品①鸡蛋白溶液100ml:讲鲜鸡蛋的蛋白与蒸馏水按1：20混匀后，用六层纱布过滤；②大豆提取液100ml：将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状用纱布过滤；③头发；④指甲；⑤ 0.5%苯酚溶液；⑥浓硝酸；⑦0.3%色氨酸溶液；⑧0.3%酪氨酸溶液；⑨10%氢氧化钠溶液；（三）实验方法按下表所示顺序和剂量向7个试管中分别加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。

待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。

蛋白质和氨基酸的黄色反应实验（四）实验记录六、坂口反应（一）实验原理1、 精氨酸和许多胍代化合物与，α－萘酚在碱性次溴酸钠溶液中发生反应，产生红色物质。

精氨酸是唯一呈正反应的氨基酸，反应极为灵敏，该反应可用于定性鉴定含有精氨酸的蛋白质和定量测定精氨酸。

（二）实验药品（1）0.3%精氨酸溶液10mL（2）蛋白质溶液100mL（配法见黄色反应）（3）20%氢氧化钠溶液100mL（4）1% α－萘酚－乙醇溶液20mL（临用时配制）（5）次溴酸钠溶液10mL（三）实验方法本实验十分灵敏。

α－萘酚要过量。

次溴酸钠及蛋白质均不可过多，过多的次溴酸钠可继续氧化有色物质使其颜色消失。

分别按下表所示顺序和剂量向各试管中加入试剂，记录出现的现象。

七、乙醛酸反应（一）反应原理在浓硫酸存在的情况下，色氨酸与乙醛酸反应生成自身物质，反应机理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与靛蓝相似的物质。

含有色氨酸的蛋白质也有此反应。

（二）实验药品1．鸡蛋白溶液（鸡蛋清：水=1：20）；2．0.03%色氨酸溶液；3. 冰醋酸4. 浓硫酸（分析纯）（三）实验方法取3支试管编号。

分别按表所示顺序和剂量加入鸡蛋白溶液、色氨酸溶液和水，然后各加入冰醋酸2ml，混匀后倾斜试管，沿管壁分别缓缓加入浓硫酸约1ml，静置。

观观察各管液面间紫色环的出现。

若不明显，可于水浴中微热（注意本实验极为灵敏，色氨酸和蛋白质的量不宜过多）。

（四）实验记录八、偶氮反应（一）实验原理偶氮化合物与酚核或咪唑环结合产生有色物质。

它与络氨酸和组氨酸反应的产物分别为红色和樱桃红色。

含有络氨酸和组氨酸的蛋白质也有此反应。

（二）实验药品1.鸡蛋白溶液（鸡蛋清：水=1：1）；2.0.3%组氨酸溶液；3.0.3%络氨酸溶液；4.20%氢氧化钠溶液；5.重氮试剂：溶液A：取5g亚硝酸钠溶于1000ml水中。

溶液B：取5g对氨基本磺酸溶于900ml水中，溶解后，再加入5ml浓硫酸，然后定容至1000ml。

溶液A、B分别保存在密闭瓶中，用时以等体积混合。

（三）实验方法取三支试管编号。

按表2-4所示顺序和剂量加入试剂，并观察产物的形成。

九、醋酸铅反应及亚硝基铁氰化钠反应（一）实验原理蛋白质分子中常含有半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白质在强碱条件下，可分解形成硫化钠。

硫化钠与醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀。

若加入浓盐酸，就生成有臭味的硫化氢气体（蛋白质和氨基酸对强碱稳定，不发生此反应）。

反应式如下：R-SH+2NaOH----R-OH+NaS+H2ONaS+Pb2+---PbS+2Na+PbS+2HCl---PbCl2+H2S含有巯基的半胱氨酸在碱性条件下与亚硝基铁氰化钠反应形成玫瑰色物质。

反应式如下：[Fe(CN)5NO]2-+SH----[Fe(CN)5NOSH]3-[Fe(CN)5NOSH]3---OH----[Fe(CN)5NOS]4-+H2O(二)实验药品1.50ml鸡蛋白溶液（鸡蛋清：水=1:1);2.0.3%半胱氨酸溶液；3.10%氢氧化钠溶液；4.浓盐酸；5.0.5%醋酸铅溶液；6.5%亚硝基铁氰化钠溶液；7.醋酸铅试纸：用10%醋酸铅水溶液浸泡滤纸条后晾干。

（三）实验方法1.向试管中加入0.5%醋酸铅溶液1ml，再加入10%氢氧化钠溶液至产生的沉淀完全溶解为止，摇匀，加入鸡蛋溶液（1：1）0.4ml，混匀小心加热，至溶液变黑后，加入浓盐酸数滴，嗅气味，并将湿润醋酸铅试纸置于管口，观察其颜色变化。

2.将一滴0.3%半胱氨酸溶液滴加在白瓷盘中，加10%的氢氧化钠三滴，再滴加5%亚硝基铁氰化钠溶液3滴，观察玫瑰红颜色的生成（此颜色不稳定，很快消失）。