聚磷菌的培养
背景：污水中的磷和氮含量过高是造成水体富营养化的主要因素。
而其中的磷不像氮那样可以结合氧转化为气体，含磷的气态物质（PH3）又不易转化，所以污水除磷一直都用生物除磷法。
即用细菌等微生物来摄取水中的磷，达到除磷的效果。
而为了提高微生物除磷的效率、便于和其他材料协同使用，筛选、培养除磷细菌也是必不可少的工作。
培养菌种\菌落：聚磷菌（PAOs）
菌落来源：废水除磷工艺中的活性污泥
菌落组成：主要由β—2亚群紫色细菌、不动杆菌、红环菌属和绿单胞菌属组成；其中不动杆菌为主导细菌，除磷作用突出
聚磷菌除磷机理：
①好氧条件下，聚磷菌不断摄取并氧化分解有机物，产生的能量一部分用
于磷的吸收和聚磷的合成，一部分则使ADP与H3PO4结合，转化为ATP
而储存起来。
细菌以聚磷的形式在细胞中储存磷，其量可以超过生长所
需，这一过程称为聚磷菌磷的摄取。
处理过程中，通过从系统中排除高
磷污泥以达到除磷的目的。
②在厌氧条件下，聚磷菌体内的ATP进行水解，放出H3PO4和能量，形成
ADP。
这一过程称为聚磷菌磷的释放。
聚磷菌除磷则就是通过以上两种过程完成的。
培养过程：
1、材料准备
1.1取样：
从实验室运行稳定的厌氧\缺氧SBR反应器中，取富含反硝化聚磷菌的
活性污泥做为实验样品。
1.2培养基配方：
( 1 ) 牛肉膏蛋白胨培养基（L1-）：蛋白胨10 g；牛肉膏3 g；NaCl 5 g；琼
脂20 g ；p H 7.2 ，用于反硝化聚磷菌的分离、纯化
( 2) 缺磷培养基（L1-）：CH3COONa 2g ；Na2HPO4·2H2O 23 mg；
CaCL2·2H2O 11 mg；NH4C1 152.8mg；MgSO4·7H2O 81.12 mg；
K2SO4 17.83 mg；HEPES缓冲液7 g；微量元素)1( 2 mL；p H 7.2
( 3) 富磷培养基（L1-）：CH3COONa 2g；K2PO4 25mg；NH4C1 305.52 mg；
MgSO4·7H2O 91.26 mg；CaC12·2H2O 25.68mg；PIPES缓冲
液8.5 g ；2 m L 微量元素；p H 7 .2
( 4 ) 硝酸盐还原产气试验培养基（L1-）：牛肉膏3 g ；蛋白胨5g ；KNO3 1 g ；
p H 7.4 。
2~4类培养基用于反硝化聚磷菌的筛选。
2、培养基制作
2.1牛肉膏蛋白胨培养基
A 根据需要计算每个培养基所需要的药品质量
B 按培养基配方、具体计算量和比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入
烧杯中。
(牛肉膏可用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒
入烧杯)
C先在上述烧杯中加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，再将称好的琼脂放入已溶化的药品中，然后在石棉网上加热使其溶解、溶化。
（在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂）最后补足所失的水分到所需的总体积。
D 用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐
滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，直至pH达7．2。
反之，则用1mol/L HCl
进行调节。
（注意pH值不要调过头，以避免回调）
E 将或加热融化后的培养基冷至50℃左右，以无菌手续倾人灭菌平皿内，轻摇平
皿底，使培养基平铺于平皿底部，再次高压灭菌，之后待其凝固即可。
（灭菌后的培养基要放入37℃养箱中培养24小时，以检验灭菌的效果）
F 检验合格的培养基编号待用。
可放在4℃冰箱内保存，但是不宜存放时间过久
2.2缺磷培养基
A 根据需要计算每个培养基所需要的药品质量
B 按培养基配方、具体计算量和比例依次准确地称取各类药品。
先在三角烧瓶中
加入少量蒸馏水，再加入各种称量好的药品
C 搅拌、适当加热使药品溶解，并加蒸馏水至所需体积
D用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，直至pH达7．2。
反之，则用1mol/L HCl
进行调节。
（注意pH值不要调过头，以避免回调）
E用滤纸过滤，直至液体培养基清晰便于观察即可
F根据需要将培养基分装于各个三角烧瓶中，高压灭菌。
（灭菌后的培养基要放入37℃养箱中培养24小时，以检验灭菌的效果）
G检验合格的培养基编号待用。
可放在4℃冰箱内保存，但是不宜存放时间过久2.3富磷培养基
同“缺磷培养基”
2.4硝酸盐还原产气试验培养基
A根据需要计算每个培养基所需要的药品质量
B按培养基配方、具体计算量和比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、KNO3放
入烧杯中。
(牛肉膏可用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后
倒入烧杯)
C搅拌、适当加热使药品溶解，并加蒸馏水至所需体积
D 用滤纸过滤
E根据需要将培养基分装于各个三角烧瓶中，高压灭菌。
（灭菌后的培养基要放入
37℃养箱中培养24小时，以检验灭菌的效果）
F 检验合格的培养基编号待用。
可放在4℃冰箱内保存，但是不宜存放时间过久
2、菌株的分离、纯化、筛选
2.1菌株的分离、纯化：
A）取10m L污泥至装有90mL无菌水三角瓶中，加入玻璃珠，将三角
瓶放入空气振荡器中，把污泥充分摇匀打碎。
B）打碎后的污泥经倍比稀释，在牛肉膏蛋白胨培养基上采用涂布平板
法)2(分离、纯化)3(。
2.2菌株初筛：
A）选取分离、纯化后所得斜面菌种，首先在缺磷的乙酸合成培养基中
进行预培养（按分组）：先用1 mol／L的氢氧化钠将pH值调到7，然后
各组培养物在30℃、140r／min的摇床)4(上过夜培养。
B）菌体细胞以10000r／min离心出来，之后用无菌蒸馏水洗涤、离心，重新悬浮于富磷培养基中（整个过程均在无菌操作台上进行），然后在
30℃摇床中进行扩大培养，
C）培养24h后，每组大约取10 mL菌液，滤纸过滤取澄清的无菌液体
PO-P 含量的变化。
培养基，利用钼锑抗分光光度法测定接种后 3
4
D）取摄磷率高于50％的菌株分别进行硝酸盐还原产气试验)5(、异染颗
粒染色)6(和聚—β—羟丁酸(PHB)颗粒染色)7(试验。
既能过量摄磷又具
有反硝化功能并有异染颗粒和PHB颗粒的菌株即为高效DNPAOs
2.3*菌株复筛（本步骤是为了筛选耐低温的聚磷菌，若对低温没有要求则可以省去）：
A）通过设置温度梯度的方法对各株菌进行降温驯化培养。
驯化培养过。