(二)微生物检验
(1)标本直接抗原检测：免疫荧光法进行检测。
(2)标本直接核酸检查：按16SrRNA非保守区 序列合成寡核苷酸探针，能检出5pgrRNA， 如将非保守区特异性扩增，其敏感性可达 检出1—10个贝纳柯克斯体的水平。
用贝纳柯克斯休质粒DNA片段制备的探针， 不仅能快速检出病原体，且能鉴别含QpHI 或QpRS质粒分离株，与呼吸道感染病原体 DNA无交叉反应。试验仅需8—12h即可得 到结果。
(2)PCR：可检出20ng恙虫病立克次体DNA；套 式PCR法可检出200pg，是目前最为快速、特 异、敏感的实验室诊断方法，可用于急性期 患者的早期诊断。
依据56KD蛋白抗原基因或58KD蛋白抗原基因 序列选择引物，进行目的 DNA 扩增，然后用 1．5％琼脂糖电泳法检出特异性DNA带。
(3)分离培养
引物R17-1、-2在65℃条件下能扩增普氏和莫 氏立克次体 DNA。在琼脂凝胶上产生一条 340bp的核酸带；
引物R169-1、-2仅能扩增普氏立克次体DNA， 产生一条432bp的核酸带。两种引物同时使 用，扩增后普氏可产生340bp和432bp两条带， 而莫氏只产生340bp一条带。
该法敏感性可达0．05ngDNA水平，重复性 好，操作方便，对两型立克次体早期、鉴别 诊断以及自然生态宿主调查研究具有较大价 值。
3.有群特异性和种特异性两种抗原。大部分 立克次体与普通变形杆菌X菌株的菌体耐 热多糖抗原有共同的抗原性，故可用这些 菌株代替立克次体抗原进行凝集反应去检 测抗体，这种交叉凝集试验被称为外斐反 应，可供辅助诊断。
外斐反应
立克次体病
变形杆菌 变形杆菌
ห้องสมุดไป่ตู้
OX19
OX2
流行性斑疹伤寒 ++++
+
地方性斑疹伤寒 ++++
2．培养特性
(1)动物接种：小鼠最敏感，刮取腹膜上的粘 液涂片检查，可见细胞质内有大量立克次 体，尤以腹膜上皮细胞内多见，常密集于 细胞核旁。
(2)细胞培养：恙虫病立克次体可以在多种细 胞内生长、繁殖，多采用Vero、L929细胞 进行培养。细胞感染需要适宜的温度和吸 附时间，通常以37℃吸附1h，培养32℃为 宜，繁殖缓慢，用Vero细胞培养8—9d， 在细胞质内生长繁殖，在细胞核旁高度密 集，但不侵入细胞核。
(1)外斐反应
除Q热、立克次体痘及罗沙利马体感染为阴性 外，其他为阳性。 患者OX凝集素上升较晚，在病程2周左右方出 现阳性，病程中双份血清试验，若效价有4倍 增长，方有诊断意义。
有些病例在病程中效价不见上升，约15％的 经疫苗接种后感染斑疹伤寒的病例。有些 轻症斑疹伤寒或某些发病严重者，其他血 清学试验阳性，但外斐反应可为阴性。
(二)微生物特性
1. 比细菌小，呈多形态性，在感染细胞内聚 集成团,分布在胞质内, Gimenez法染色后 呈红色，外表含有微荚膜结构。
2. 必须在真核细胞内才能生长繁殖，培养时 需要C02。通常采用5-9日龄鸡胚作卵黄囊 接种，于32℃-35℃孵育4～13d内死亡，鸡 胚死亡时间与接种剂量大小呈直接相关。普 氏和莫氏立克次体能在多种单层细胞上生长 繁殖。豚鼠可作立克次体的初代分离。
四、贝纳柯克斯体
又称Q热立克次体，是引起Q热(疑问热，指最 初不明病因的发热)的病原体。
传染源主要是受染的牛、羊等家畜，以蜱为 传播媒介，对人感染力特别强，通过接触、 呼吸道、消化道等途径使人及动物发生感染。
Q热除有发热、头痛及肌肉痛外，以出现肺炎 和肝炎为其临床特征。
慢性Q热主要表现为心内膜炎。
(4)CF试验
CF试验原来是立克次体病血清学诊断的 经典试验，虽然敏感性不如IFA和 ELISA， 但非常特异。一般在立克次体病发病一周内， 血清中即有CF抗体出现，以后逐渐上升， 至第3周达最高峰，然后逐渐降至较低的效 价，并可保持几年不消失，但也有在病后几 周即转阴性者。病人恢复期血清与斑疹伤寒 群及斑点热群立克次体可溶性抗原试验的阳 性结果，只能说明该群立克次体的感染 。
+
斑点热
++++/+ +/+ +++
恙虫病
-
-
腺热
-
-
变形杆菌 OXk ++++ ++
(三)微生物检验
1.标本采集 (1)病人血液标本：发热期均有立克次体血症，
在急性期较易检出立克次体。争取在用抗生 素前采血，立即床侧接种。 (2)活检或尸检材料：肺、肝、脾、淋巴结、心 瓣膜等标本。
2.标本直接检查
（一）微生物特性
1.形态与结构 个体较小，多为短杆状，常排列 成对，Gimenez法染色呈红色，背景呈绿色， 用Giemsa法染色呈紫红色。有荚膜，在鸡胚 卵黄囊或细胞培养内均可有芽胞形成。
2.基因组与抗原成分 基因组分子量为大肠杆菌 的1／3；编码代谢酶、表面抗原与毒力因子 有关基因。有两相抗原，Ⅰ相为光滑型LPS， Ⅱ相为粗糙型短链LPS。
3．分离培养
病原体分离只是在该地区尚未证明有Q 热存在，病情特别严重有必要。将标本 接种于豚鼠或培养细胞，观察其发病与 否或生长情况，经形态学、血清免疫学 等鉴定后作出结论 。
4．抗体检测
用间接免疫荧光试验、ELISA和CF试验。 CF试验中抗原相的选择对结果影响极大，对 现症诊断主要看Ⅱ相抗体逐渐上升，若Ⅰ相 抗体保持较高水平，则往往说明慢性感染或 隐性感染。
五、埃立克体
(一)临床意义为埃立克体病病原体。 1.人腺热埃立克体病 可能由蜱传播，也
可能由于摄食生鱼引起。临床表现为发 热头痛、淋巴细胞数增加，并出现非典 型淋巴细胞。。 2.人单核细胞埃立克体(HME)病，主要侵 染人的单核细胞和巨噬细胞。传播媒介 为蜱。
3．人粒细胞埃立克体(HGE)病 主要侵犯人 粒细胞。硬蜱是传播媒介。也是莱姆病 病原体的携带和传播者，故与莱姆病的 相重叠。
斑点热病人外斐反应效价通常为OX19高于 OX2，但也有OX2较高者。若仅出现OX2 阳性，则对诊断斑点热有特殊意义。
(2)IFA试验
为现在诊断立克次体病常用的方法。用已知 立克次体抗原(感染鸡胚卵黄囊或细胞培养 悬液)制片，以低稀释度的病人血清初筛， 有呈典型立克次体形态的明亮荧光颗粒者， 判为阳性。再将病程早期及晚期血清分别作 双倍或4倍稀释以测效价，如呈4—8倍增长 者可明确诊断。
(4)抗体检测
外斐试验：临床血清学诊断方法，血清抗 体OXk效价达l：160以上有意义，病程中双 份或多份血清试验，若效价有4倍增高，有 诊断意义。由于外斐试验特异性、敏感性 低，容易造成误诊或漏诊，不应作为恙虫 病的诊断方法。
免疫荧光试验：快速敏感特异，可分别检 测 患 者 血 清 中 的 抗 恙 虫 病 立 克 次 体 lgG、 IgM抗体，效价在1：80以上有诊断意义。 双份血清有4倍或以上增长可以确诊。
(2)鉴定
用免疫荧光法鉴定感染动物脏器、鸡胚卵 黄囊、细胞培养物中的特异性抗原以已知 抗原测定动物恢复期血清中的相应抗体。 必要时用补体结合试验、微量凝集试验等， 作群和种的鉴定。
(3)分离株繁殖及保存
①鸡胚卵黄囊培养 收获卵黄囊，经涂片染 色镜检, 含立克次体较多而又未发现细菌 的卵黄囊膜，或将其作成适当浓度的悬 液置-70℃冰箱保存，或冰冻干燥保藏；
一、斑疹伤寒立克次体
(一)临床意义
1．普氏立克次体是流行性斑疹伤寒(又称虱传 斑疹伤寒)的病原体。 病人是惟一的传染源，体虱是主要传播媒介， 而非储存宿主。 传播方式为虱-人-虱，体虱仅是传染媒介。
莫氏立克次体
地方性斑疹伤寒(又称鼠型斑疹伤寒)的病原 体。啮齿类动物是主§宿主，传播媒介是鼠 蚤或鼠虱。
第26章立克次氏体和衣原体
第一节 立克次体
对人致病的立克次体有五个属立克次体属、 柯克斯体属、东方体属、埃立克体属和巴 通体属。
共同特点
①大多是人畜共患病原体，引起人类发热和出 疹性疾病；
②以节肢动物为传播媒介或为储存宿主； ③大小介于细菌与病毒之间，光镜下呈多形态
性，主要为微，杆状或球杆状，革兰阴性； ④除了少数外全是专性活细胞内寄生； ⑤菌体内同时含有DNA和 RNA两类核酸； ⑥以二分裂方式进行繁殖； ⑦对抗生素敏感。
(1)免疫荧光检测 用于脏器检查。制备标本片 薄而均匀，组织结构清晰，固定后用荧光抗 体染色, 常见脾、肺及心瓣膜中有立克次体， 也可在肝、肾及皮疹活检组织中检出。
(2)核酸检测 PCR敏感性高，所需样品量只需 ELISA实验的1／5。以编码17kD蛋白的基因 和编码普氏和莫氏立克次体169kD蛋白的基因 作为扩增靶区。
3．分离培养
(1)动物接种
选用健康雄性豚鼠接种以便观察阴囊肿胀现 象。每日测体温，至40℃发热时采血或脏器 悬液、接种鸡胚卵黄囊或细胞培养以分离立 克次体；
感染莫氏立克次体豚鼠在发热1—2日内出现 阴囊红肿，解剖可见腹股沟淋巴结肿大、充 血、脾大2-3倍，有腹水；有阴囊反应者，睾 丸有小出血点，鞘膜充血并有浆液性渗出物 等。鞘膜涂片可查到立克次体。
(3)ELISA
检测IgM抗体对早期诊断有价值。
立克次体抗原吸附于载体。泛影葡胺梯度离心纯化 抗原为优，检出血清的抗体效价高，纸上ELISA测 定抗体，方法简便。将感染卵黄囊悬液加于玻片 (经氯仿·甲醇洗净)上，凉干、固定，加稀释血清 于抗原点上，每张玻片上包括阳性和阴性对照，加 酶标兔抗人IgM/G于抗原·血清点作用后，将浸透新 鲜配制的底物无灰滤纸覆盖在玻片上约4-6min，可 见滤纸条上阳性对照点位置显紫棕色，取下滤纸条 (即终止反应)，观察是否显色，与对照比较判定结 果。此法简便，并可保存实验记录。
三、恙虫病立克次体
又名东方立克次体是恙虫病的病原体，由恙 螨叮咬侵入人体，对人体致病性很强，释放 的毒素样物质是主要致病因素，引起发热皮 疹全身中毒症状，以及全身淋巴结肿大及各 组织器官的血管炎病变。虫咬处溃疡形成黑 色焦痂，周围有红晕等为其特征。为自然疫 源性疾病。