3500基因测序仪操作流程
一、启动仪器
1．按下仪器的电源键，当仪器指示灯为绿色时表明仪器正常开启。

2．打开与仪器连接的计算机，点击Ctrl+Alt+Delete界面，点击Administrator，输入密码：Administrator。

等待Daemon（隐藏图标），Server Monitor程序完全启动，Server Monitor图标上出现绿色对号时表示连接成功。

3．打开3500 Data Collection 软件，出现3500 Log In 登录界面，输入用户名和密码，本机用户名为：Administrator，密码为：Administrator1，点击“OK”，打开软件。

检查所有耗材的剩余用量、仪器的信息、耗材的使用信息以及仪器维护提示灯信息。

4. 确认检测阴性、阳极缓冲液在刻度线以上，以及确认所有耗材已恢复至室温。

注：3500测序所用到的阳极缓冲液、阴极缓冲液在仪器上可存放一周，POP 胶在仪器上存放一周后需置于2-8℃保存，洗液为一次性消耗品，不可重复使用。

5. 将阴性缓冲液、阳极缓冲液、洗液等耗材安装至仪器上后，点击refresh，确认所有耗材均为有效状态。

二、仪器维护
1. 于软件主界面点击Dashbord，于菜单栏中选择Maintenance Wizards选项。

2. 将装有阳极缓冲液的耗材从仪器中取下，安装没有阳极缓冲液的容器，选择WASH pumper chamber and chanels选项，按照仪器指示，开始清洗管路并重新给毛细管灌胶直至完成全部操作。

3. 从Maintenance进入Spatial界面，按图示指示进行空间定位。

结果应满足如
下要求：①峰高大致相同（大于6000）；②峰型尖锐，左右堆成；③橙色十字在峰顶端；④峰间距为13-16。

当结果满足要求时，选择“Accept Results”，否则，选择“Reject Results”，重新进行空间定位。

4. 从Maintenance进入Spectral界面，按图示指示进行光谱校准。

本仪器为8道毛细管，光谱校准品加样的位置为A1-H1，校准结果允许借用周边1道毛细管的结果；光谱校准通过显示绿色，借用信息为黄色箭头，失败为红色。

校准成功选择“Accept”，否则，选择“Reject”，重新进行光谱校准。

三、检测运行
1. 测序PCR（以BigDye Terminator v3.1试剂盒为例），标准质粒和样品推荐测序反应体系及反应条件如下：
标准质粒测序反应体系：引物4 μL，Big dye 1 μL，BigDye Seq Buffer 3.5μL，超纯水10.5 μL，模板1 μL。

样品测序反应体系：引物（10 μM）0.5 μL，Big dye 1 μL，BigDye Seq Buffer 3.5μL，超纯水14 μL，模板1 μL。

测序反应条件为：96 ℃ 1 min →(96 ℃10 sec →50 ℃ 5 sec →60 ℃4 min)×25个循环→4 ℃保温
2. 测序产物纯化（以CENTRI-SEP spin-columns纯化柱为例介绍）
①于纯化柱中加入800 μL的无RNase超纯水，颠倒混匀，室温静置30 min。

②上下颠倒除尽气泡，去掉纯化柱底部的盖子，置于2 mL洗脱管中，在将纯化柱上部的盖子打开后，盖上盖子，压入空气，柱中的液体自动流入洗脱管中直至自行终止，最后洗脱管中的液体大约为200-250 μL，弃掉滤液。

③750×g离心2 min去除多余液体，离心完毕后洗脱管中约有300 μL液体。

④将纯化柱转移至1.5 mL的样品收集管中，从柱的斜面上缓缓加入20 μL的PCR测序产物。

⑤ 750×g离心2 min，取滤液备用，静止重复离心。

3. 测序产物加样
①于待检测孔中加入10 μL的Hi-Di甲酰胺后，再次加入10 μL纯化后测序产物，混匀，尽量避免气泡产生，不加样的空中加入10 μL的超纯水。

②于96孔板上安装胶垫，按照顺序组装到自动进样器上。

4. 数据收集软件运行
①点击Start pre-heat预热30 min，POP7和POP4的胶预热到60 ℃，POP6的胶预热到50 ℃，预热后检查detection cell的温度。

②通过Main workflow键进入Set up视窗，选择Define Plate Properties界面建立新的样品反应板，在Name栏输入样品板的名称，板子类型：96孔板，毛细管长度：50 cm，胶以及测序类型根据需要选定。

③输入样本名称，选择相应的Assays，File Name Conventions，Results Groups。

④切换到Load Plates for Run视图，从Recent Plates找到要电泳的反应板，点
击Link Plate（灰色表示反应板连接上，黑色则表示没有连接上），点击Start Run 进行电泳。

⑤切换到Monitor Run 视图，通过Assay，Sample，EPT界面查看样品的电泳
情况；通过Flags Found 界面借助软件可直接判断样品的结果是否满足质量要求，红色旗帜表示不满足质量要求，绿色旗帜表示满足质量要求。

⑥进入Review Results视窗，点击View Fragment/HID Results 查看样品的电泳
结果。

如Offscale（峰过高，导致渗透峰产生），Board Peak（宽峰）等要素的图
标为绿色方块，Sizing Quality（内标的质量）为带对号的绿色方块，则表示满足质量要求；如Offscale，Board Peak 的图标为黄色三角形，Sizing Quality为带
X的红色方块，则表示不满足质量要求，可以通过Plot View和Sizing Table View 等界面分别查看样品的电泳图谱和内标的情况。

5. 测序结果分析
①点击sequence analysis V5.4软件，输入用户名DangDongCIQ，输入密码123456，打开软件。

②点击File，选择Add sample，选择所需分析测序文件。

③点击绿色三角形图标进行测序结果分析。

测序峰图的荧光信号强度正常范围为1000-3000，且峰间距明显，测序结果质量分数较高，可视为本次测序基本成功。

6. 常见问题及解决措施
（1）信号值太高
①样品浓度过高，应稀释样本浓度，降低进样时间。

②反应体系中DNA加入过量。

（2）无信号值
①测序反应失败。

②毛细管堵塞，重新灌胶。

③毛细管阵列弯曲，应重新更换毛细管阵列。

④毛细管破裂或损坏
（3）低信号值
①甲酰胺降解，更换新的Hi-Di甲酰胺。

②样本量不足，增加DNA的量。

③样本中盐浓度过高，采用蒸馏水或去离子水对样本进行稀释或采用去盐的纯化柱继续样本纯化。

④测序样本未充分混匀。

⑤DNA扩增效率低，重新扩增DNA或检查DNA质量。

⑥自动进样器超出校准范围。

检查样本体积，如果信号任然很低，联系ABI技术顾问。

（4）过高的基线
①管路中的胶可能存在污染，可采用conditional reagent清洗胶泵。

②胶中可能存在污染或晶体沉淀，将胶恢复至室温使用，如果胶已过期可更换新胶使用。

③弱的光谱校准，重新进行光谱校准。

（5）分辨率低
①进样量过多。

②低质量的水。

③POP胶已降解。

④毛细管阵列的进样次数超过160次。

⑤降解的甲酰胺。

⑥样品中盐浓度过高。

7. 关闭仪器
先将数据收集软件和
测序软件等程序关闭后，关闭仪器的电源，随
后关闭计算机。