木薯酒精发酵实验一、实验目的掌握酒精发酵的基本原理。

二、实验原理酒精发酵是在厌氧条件下，己糖分解为乙醇并释放出二氧化碳。

酒精发酵的类型有3种：即通过EMP途径的酵母菌酒精发酵、通过HMP途径的细菌酒精发酵和通过ED途径的细菌酒精发酵酵母菌通过EMP途径分解己糖生成丙酮酸，在厌氧条件和微酸性条件下，丙酮酸则继续分解为乙醇。

而如果在碱性条件或者培养基中加有亚硫酸盐时，则发酵的主要产物是甘油，这也是工业的甘油发酵。

因此，如果要用酵母进行酒精发酵，就必须控制发酵液的微酸性条件。

三、实验材料1. 菌种酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GGSF162. 培养基① YPD（Y east extract P eptone D extrose）broth：葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，自然pH，115℃灭菌20min。

用于种子培养。

②YPD Agar: YPD加1.5-2%(w/v) Agar，用于斜面（菌种活化）。

③木薯粉发酵培养基：料水比(1：2.3) *的木薯粉，经液化糖化，调节pH至4.5，添加相应营养盐至终浓度为MgSO4·7H2O 0.45g/L，KH2PO4 1.5g/L，CaCl2 0.2g/L，115℃灭菌20min，冷却，添加NH4Cl 0.6g/L至灭菌醪液中。

(*配置150mL发酵酒精度为6%(v/v)的发酵培养基，每瓶需木薯粉21.72g。

每人一瓶，150mL培养基装于500mL三角瓶中。

)3. 溶液及试剂①2.5g/L的标准葡萄糖溶液：称取105℃左右烘干至恒重的葡萄糖2.5g，加水溶解，加浓盐酸5mL，蒸馏水定容至1000mL容量瓶。

提前2-3天配好备用。

②用NH4Cl代替尿素，使用时终浓度为0.6g/L。

③菲林甲液：34.65g硫酸铜加蒸馏水定容至500mL。

④菲林乙液：173g酒石酸钾钠加50g氢氧化钠，加蒸馏水定容至500mL。

⑤质量分数为20%的HCl溶液(总糖的测定-消化)：浓盐酸257mL，定容至500mL容量瓶中。

⑥2mol/L H2SO4溶液(调发酵液pH)：吸取浓硫酸5.6mL缓慢加入适量水中，冷却后定容至100mL。

⑦200g/L NaOH溶液(总糖的测定-消化)：100g氢氧化钠定容于500mL容量瓶中。

⑧2mol/L NaOH溶液(酒精度测定)：4g氢氧化钠定容于50mL容量瓶中。

⑨亚甲基兰溶液（1%，w/v）:⑩消泡剂4.主要药品与试剂来源见表 1表 1主要药品与试剂Table 1 Main chemicals and reagents 产品名称规格产地/厂家葡萄糖AR 天津市科密欧化学试剂有限公司酵母浸膏BR 广东环凯微生物科技有限公司细菌学蛋白胨BR 广东环凯微生物科技有限公司磷酸二氢钾AR 广东光华化工厂有限公司无水氯化钙AR 广东台山市化工厂有限公司氯化铵AR 广东台山市化工厂七水硫酸镁AR 广东台山粤侨试剂塑料有限公司氢氧化钠AR 天津市大茂化学试剂厂盐酸AR 广东汕头市西陇化工股份有限公司硫酸AR 广东省汕头市西陇化工股份有限公司酒石酸钾钠AR 天津市大茂化学试剂厂硫酸铜AR 天津市大茂化工试剂厂次甲基蓝AR 天津市北联精细化学试剂有限公司5. 主要仪器设备本试验所使用的主要仪器设备见表2。

表 2 主要仪器设备Table 2 Main instruments and equipments 产品名称规格产地/厂家全温度恒温调速摇床柜101-3型微电脑控制生化培养箱LRH－250－Ⅱ广东省医疗器械厂电子天平T－500 美国双杰兄弟（集团）有限公司电子分析天平AB104－N 梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司酒精浓度计MC 河北武强县同辉仪表厂全自动新型鼓风干燥箱ZFD－5230 上海智城分析仪器制造有限公司立式压力蒸汽灭菌器LS-B35L-I不锈钢电热蒸馏水器15KW－20L 上海博讯实业有限公司医疗设备厂光波炉YS－A007B 广东省茂名市亚洲电器有限公司旋涡混合器XW－80A 上海精科实业有限公司四、方法步骤1 酿酒酵母GGSF16发酵性能的测定（1）酵母菌种培养流程酵母菌种培养流程：试验室保藏菌种——斜面活化——一级种子培养——接种发酵斜面活化：无菌操作将试验室保存的酵母GGSF16接种到斜面培养基上，32℃培养1d-2d。

（2）酿酒酵母GGSF16木薯粉酒精发酵性能的测定称取过40目筛的木薯粉以料水比1：2.3的比例混合于60℃的自来水中，按10U/g木薯粉的量加入液化酶，搅拌混匀后60℃下保温30min。

迅速升温到90℃，保温液化1.5h后，于115℃灭菌30min，然后冷却至室温。

以2mol/L H2SO4调pH至4.5，按NH4Cl 0.6g/L(称1.56g，加蒸馏水溶解即可)，MgSO4·7H2O 0.45g/L（称1.17g，加水量同上），KH2PO41.5g/L（称3.9g，加水量同上），CaCl20.2g/L（称0.52g，加水量同上）的量加到醪液中，加入150U/g木薯粉的糖化酶。

按接种量为10％接种酿酒酵母GGSF16至液化糖化后的醪液中，分别取样10mL置于两个三角瓶中用于测定初总糖和初还原糖。

余下的分装到15个三角瓶，分别接上发酵栓，称重，并于33℃发酵，转速为120r/min，摇床培养24h，期间定时称重。

发酵结束后，测定酒精度，残总糖和残还原糖。

2. 分析方法2.1还原糖的测定(1)试样的制备：称取糖化醪试样10mL定容至250mL，过滤，滤液摇匀备用。

(2) 斐林试剂所消耗葡萄糖标准溶液的体积标定A.预备试验：吸取费林甲液、乙液及标准葡萄糖液各5mL于250mL三角瓶内，加20mL水，摇匀，加入数颗玻璃珠，在电炉上加热沸腾，加入亚甲基兰溶液（1%，w/v）2滴，盖住表面皿，保持沸腾以避免空气中氧气的干扰，在沸腾状态下用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失为止。

记录标准葡萄糖液消耗的总体积。

B.正式试验：吸取费林甲液、乙液及标准葡萄糖液各5mL于250mL 三角瓶内，加水20mL，加入少于预备试验1毫升的2.5g/L标准葡萄糖溶液，加入玻璃珠数颗，置电炉上沸腾2min，滴入亚甲基兰2滴，沸腾状态下1min内以标准葡萄糖溶液滴定，至溶液蓝色刚好消失。

记录标准葡萄糖液消耗的总体积，并做平行试验，使两次滴定结果之差在0.1mL之内。

(3) 试样还原糖的测定A.预备试验：吸取费林甲液、乙液及待测液各5mL于250mL三角瓶内，加20mL水，摇匀，加入数颗玻璃珠，在电炉上加热沸腾，加入亚甲基兰溶液2滴，盖住表面皿，保持沸腾以避免空气中氧气的干扰，在沸腾状态下用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失为止。

记录标准葡萄糖液消耗的总体积。

B.正式试验：吸取费林甲液、乙液及待测液各5mL于250mL三角瓶内，加水20mL，加入少于预备试验1毫升的2.5g/L标准葡萄糖溶液，加入玻璃珠数颗，置电炉上沸腾2min，滴入亚甲基兰2滴，沸腾状态下1min内以标准葡萄糖溶液滴定，至溶液蓝色刚好消失。

记录标准葡萄糖液消耗的总体积，并做平行试验，使两次滴定结果之差在0.1mL之内。

2.2总糖的测定试样制备：称取10mL糖化醪试样于250mL三角瓶中，加70mL水和20mL质量分数为20%的HCl溶液，沸水浴中水解60min，冰水迅速冷却，以200g/L的NaOH溶液(大约20ml)中和到微酸性，过滤定容到250mL，滤液摇匀备用。

预备试验：同还原糖的测定。

正式试验：同还原糖的测定。

2.3酒精度测定准确量取发酵醪100mL，用100mL蒸馏水洗涤至500mL蒸馏瓶中，加入5mL 2mol/L的NaOH溶液，消泡剂2滴，玻璃珠数个，加热蒸馏收集于100mL量筒中，待馏出液接近刻度时（约96mL）取下，加水至刻度，摇匀，用酒精计和温度计同时测酒精和温度，并换算成20℃的酒度（％，v/v）。

2.4. CO2失重测定方法接种完毕后，用电子天平称量发酵瓶，在发酵过程中每8h称重一次（称重前应先摇晃发酵瓶，以除去发酵醪液中的CO2），直至CO2失重＜0.2g，发酵结束。

2.5附加信息(1)配置150mL发酵酒精度为6%(v/v)的发酵培养基，每瓶需木薯粉21.72g，则19瓶共需木薯粉：19*21.72=412.68g(2)液化酶（20,000U/mL）：按10U/g木薯粉的量加入加入液化酶的量=10×347.52/20000≈0.174mL=174μmL(3)糖化酶（100,000U/mL）：按150U/g木薯粉的量加入加入糖化酶的量=150×347.52/100000≈0.522mL=522μmL(4)实验所需仪器：40个500mL三角瓶、16个发酵栓、3个100mL量筒、250mL量筒若干（滴糖用）、电炉、50mL滴定管、若干个250mL 三角瓶、10mL吸量管、5mL移液管、烧杯、容量瓶（1000mL、500mL、250mL、100mL、50mL）、蒸馏设备、吸耳球、5000mL三角瓶一个。

(5)木薯粉的淀粉含量为：71%(w/w)；淀粉变为葡萄糖[(C6H10O5)n+nH2O=nC6H12O6]的理论转化率为：111.11%(w/w)；葡萄糖转化为乙醇的理论转化率为：51.1%; 酒精在20o C的密度为：0.789 g/mL。

(6) 附表酒精度与温度校正表四.实验记录与计算4.1 记录发酵流程时间40目筛筛过的木薯粉(21.72x16=347.52g,取348g)→加水定容至2600ml，并加入液化酶→60℃恒温30min→迅速升温至90℃，保持90min→115℃灭菌30min→冷却至室温→用H2SO4调pH至4.5→加营养盐→加糖化酶→按10%的接种量（250mL）接种到糖化醪（最终体积大约为2500mL）中→取样测粗总糖和初还原糖，分装15个三角瓶→接上发酵栓并加入浓硫酸，称重→摇床培养24h，设定温度33℃，转速120r/min→定时称重（每4小时称一次）→发酵结束，测残糖、残还原糖、酒精度2013-5-18（星期六）10:30—筛粉（过40目筛）10:40—称量413 g木薯粉10:50—调浆定容至（3000）ml左右11:00—加液化酶（山东隆大生物工程有限公司，执行标准：QB/T2306-97）14:00—灭菌锅（立式压力蒸汽灭菌器：LS-B35L-Ⅰ）预热14:07—灭菌锅升温至60℃，保持30min14:37—液化14:47—灭菌锅升温至90℃，保持90min16:17—开始灭菌16:26—灭菌锅升温至115℃，保持,30min16:56—灭菌结束17:34—出锅18:13—培养基冷却完毕18:25—调pH（2mol/L H2SO4约5.8ml, 2600ml培养基）18:29—加营养盐18:41—加糖化酶（山东隆大生物工程有限公司，执行标准：QB1805.2-93）522微升18:45—接种300ml(种子)18:50—分装,同时各取10ml培养基测初总糖、还原糖19:12—分装完毕19:14—接发酵栓，用保鲜膜代替19:33—接发酵栓完成19:38—第一次称重19:43—摇床（恒温培养振荡器：101-3型）培养（33℃、120R/min）22:52—第二次称重23:00—第二次称重完毕2012-5-19（星期日）7:05—第三次称重7:12—第三次称重完毕10:52—第四次称重11:00—第四次称重完毕15:03—第五次称重15:08—第五次称重完毕18:31—第六次称重18:35—第六次称重完毕发酵结束4.2 称重数据编号第一次称重第二次称重第三次称重第四次称重第五次称重第六次称重1 2 3 4567891011121314151617184.3 计算方法在本次实验中，我测定的是2号发酵液，以下是我的测定结果及其相应的计算。