酵母细胞的固定化及其酒精发酵试验
一、实验目的
1.掌握微生物细胞的固定化方法；
2.学习用固定化酵母进行酒精发酵；
3.进一步理解淀粉质原料酒精发酵的原理
和一般工艺过程。

二、实验原理
（一）酵母菌酒精发酵
在无氧条件下，酵母菌利用葡萄糖或淀粉水解糖发酵产生乙醇和CO2的作用，称为酒精发酵，总反应式为：
C6H12O6→2C2H5OH+2CO2
酒精发酵是生产酒精及各种酒类的基础。

本实验采用固定化酵母发酵，通过测定发酵过程中的酵母细胞数、生成的CO2量以及最终产物酒精的量，可以判断固定化酵母的发酵能力。

（二）细胞固定化技术
固定化细胞就是被限制自由的细胞。

即采用物理或化学的方法将细胞固定在载体上或限度在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并能反复或连续使用。

微生物细胞的固定化方法有：
（1）吸附法，
（2）包埋法，
（3）不用载体法。

本实验采用凝胶包埋的固定化方法，把酵母细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，再滴加入CaCl2溶液，形成海藻酸钙凝胶小球，细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。

三、实验器材
（一）淀粉的液化与糖化（双酶法）
1. 酵母菌细胞：酒精活性干酵母。

2. 2.5%海藻酸钠溶液40mL，2 % CaCl2溶液100mL。

3.培养基：
①增殖培养基：浓度为130BX麦芽汁，以6N硫酸调节pH值至4.1~4.5。

（每组100mL 装于250mL三角瓶，1kg/cm2，灭菌30min后备用）
②发酵培养基：淀粉水解液，具体制备见实验步骤。

4. 培养箱、显微镜、蒸馏装置及其他常规实验仪器
四、实验方法
①调浆:以1﹕3~3.5的比例，将玉米粉（或玉米淀粉）用60℃左右的温水调成粉浆500mL;
②液化：加α-淀粉酶（用量约为10u/g淀粉）；加热至85~90℃，保持30~60 min，加热煮沸10 min，补充水分。

③糖化：将上述液化醪冷至60~62℃，加入糖化酶，用量为80~100u/g淀粉，维持
30 min后分装于500mL三角瓶，每瓶装糖化醪250mL。

糖化醪质量检查：要求糖度16~17°BX，还原糖4~6%，酸度2~3。

（二）干酵母活化
称取2g活性酒精干酵母；
加入到2%、50mL蔗糖溶液中；
在培养箱中32℃活化1h左右；
离心（3000r/min、10min），弃去上清液；
湿酵母备用。

（三）固定化操作
①将酵母湿细胞与40mL海藻酸钠溶液混合均匀；
②用注射器（不用针头）将海藻酸钠—酵母菌混合
液点滴滴入CaCl2溶液中，形成球状颗粒；
③常温下静置2h，使其充分固化；
④滤出凝胶颗粒；用无菌水洗涤2~3遍，即得固定化
酵母细胞。

（四）固定化酵母的增殖
将固定化颗粒投入增殖培养基中进行增殖，28℃、120r/min下增殖24h。

定时采用血球记数板测定酵母细胞数。

（五）固定化酵母的分批酒精发酵
将增殖后的固定化酵母颗粒，置于三角瓶发酵培养基中（安装下图），30℃进行酒精发酵，发酵时间48h左右。

定时记录发酵液的糖度及细胞数的变化。

六）CO2生成量的测定
按右图安装测定装置。

培养前，揩干三角瓶外壁，置于天平上称重，记下重量为W1；培养结束后，取出三角瓶轻轻摇动，使CO2尽量逸出，在同一架天平上再称重，记下重量为W2，则：
二氧化碳生成量＝W1 －W2
（七）酒精度的测定
先装好蒸馏装置（参见下图）；取酒精醪液l00mL，加蒸馏水l00mL，于500mL蒸馏瓶中蒸馏，取100mL馏分，用酒精比重计测量酒精浓度；同时测温度，查表换算成20℃的酒精度。

五、实验结果记录
1.记录定时测定的酵母细胞数；
2. 二氧化碳生成量= 克。

3.蒸馏液的酒精度= 度，温度为℃，换算为20℃的酒精度为度。

研究人：夏凡
指导老师：。