环境微生物综合性实验实验报告班级：组员：指导教师：学年：2012 –2013 日期：2013-03-29不同水体中微生物的分离与鉴定摘要水是微生物广泛分布的天然环境。

各种天然水中常含一定数量的微生物。

不同的水体由于受到物理、化学、生物等各个方面因素的影响,使其中所含微生物的种类和数量不同。

本实验通过对雨水和湖泊水中微生物的培养、分离与鉴定，了解自然界中的不同水体中存在的微生物的种类和数量，比较两种水体中微生物群落的分布特点，进一步了解不同水体的清洁程度。

关键词微生物雨水鱼塘水种群SOLATION AND IDENTIFICATION OF DIFFERENT MICRO-ORGANISMS IN WATERAbstract Water is the microorganism widely distributed natural environment. A variety of natural water often contains a number of micro-organisms. Different bodies of water due to the influence of the physical, chemical, biological and other factors, including the type and quantity of microorganisms contained in different. In this study, rain and lake water microbial cultivation, isolation and identification, understanding the distribution characteristics of the microbial community of the types and quantities of the different bodies of water in the nature of the micro-organisms, compare the two water bodies to learn more about the cleanliness of the different water bodies.Key words Microbial Rainwater Fish pond water Populations正文目录一、实验目的 (1)二、实验原理 (1)1. 环境背景 (1)2. 分离与鉴定原理 (1)3. 各类微生物的菌落特征 (2)4. 革兰氏染色原理 (2)三、实验材料与仪器 (3)1．实验材料与试剂 (3)2．实验仪器 (3)四、实验步骤 (3)1. 涂布培养 (3)2. 平板划线分离 (8)3. 微生物鉴定 (9)五、实验数据 (11)1．菌落特征表 (11)2．微生物个体形态特征与革兰氏染色记录表 (11)六、实验结果 (12)七、实验结果的讨论分析 (12)八、实验心得体会 (13)附件一各组员实验过程分工 (14)附件二实验过程安排表 (14)一、实验目的1．分离与鉴定鱼塘中的微生物种类。

2．分离与鉴定雨水中的微生物种类。

3．学习菌种培养和分离纯化的基本操作步骤和具体实施细节。

4．学习从菌落形态特征以及生理生化反应等三方面鉴定菌种。

5．提高进行综合分析、解决实际问题及动手操作的能力。

二、实验原理1. 环境背景水是微生物广泛分布的天然环境。

各种天然水中常含一定数量的微生物。

水中微生物的主要来源是：水中的水生性微生物（如光合藻类）、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。

水中的病原菌主要来自于人和动物的传染性排泄物。

由于水中微生物种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有微生物均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板培养菌株。

本实验主要采用牛肉膏蛋白胨培养基和PDA培养基对所采样本的微生物进行培养。

根据平板培养基上的菌落形态大致辨别菌属，挑去其中一部分优势菌落进行分离纯化培养。

确保无杂菌生长的条件下，从平板培养基上的菌落形态特征，革兰氏反应以及生理生化反应鉴定该菌的属性。

2. 分离与鉴定原理微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。

细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。

不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。

，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。

因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。

细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。

在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。

半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。

3. 各类微生物的菌落特征4. 革兰氏染色原理G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。

呈紫色。

Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。

三、实验材料与仪器1．实验材料与试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、蒸馏水、1mol/L NaOH溶液、1mol/L HCl溶液、土豆、葡萄糖、草酸结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红染液2．实验仪器烧杯、玻璃棒、电子天平、PH试纸、电磁炉、试管、锥形瓶、封口膜、报纸、标签纸、漏斗、纱布、锅、橡皮筋、高压蒸汽灭菌锅、培养皿、酒精灯、无菌玻璃涂棒、37℃恒温培养箱、24℃恒温培养箱、镊子、接种环、移液枪、无菌操作台、胶头滴管、显微镜四、实验步骤1. 涂布培养1)培养基的制作①牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基的配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15—20g、水1000ml、pH 7．4—7．6（7.0—8.0）称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。

牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。

也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。

蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。

另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。

✧溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在电磁炉上加热使其溶解。

待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。

如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。

最后补足所失的水分。

✧调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH 偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7．6。

反之，则用1mol/L HCl进行调节。

注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。

✧分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。

✧加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上包上封口膜，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。

✧包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在封口膜外包一层报纸，以防止灭菌时冷凝水润湿封口膜，其外再用一道麻绳扎好。

用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

三角烧瓶加塞后，外包报纸，用麻绳以活结形式扎好，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

②PDA培养基PDA培养基的配方：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL，pH值自然。

✧称量和熬煮药品实际用量计算后，按培养基配方逐一称取去皮土豆。

土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20－30min，用可用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。

滤液补充水分到1000ml。

✧加热溶解把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g（提前搞碎），然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再补充水分至所需量。

✧分装将配制的培养基分装入试管或500ml三角瓶内。

分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上造成污染。

分装量：固体培养基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面，分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜；半固体培养基以试管高度的1／3为宜，灭菌后垂直待凝。

✧加封口膜培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上包上封口膜或塞上塞子，以阻止外界微生物进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性能。

包扎加塞后，将全部试管用麻绳或橡皮筋捆好，再在棉塞外包一层报纸，以防止灭菌时冷凝水润湿瓶口，其外再用一道线绳或橡皮筋扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。

2)灭菌将所制作的培养基进行高压蒸汽灭菌，条件为0.1Mpa，121.℃，灭菌20分钟，冷却保存备用。

3)采样2013年3月19号上午8:00在浙江农林大学东湖校区附近的小鱼塘里取水150ml。

2013年3月19号下午2:00——4:00的雨水在浙江农林大学东湖校区收集雨水150ml.4)倒平板将牛肉膏蛋白胨培养基和PDA培养基加热融化待冷却至55~60℃时，分别倒平板，每种培养基倒8皿，每个皿中培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面，待冷却凝固。

5)涂布将上述每种培养基的4个平板底面分别用记号笔做上标记，然后用无菌吸管分别从各个试管中吸取0.2ml，小心地滴在对应平板培养基中央的位置。

右手拿无菌玻璃涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀，室温下静止5~10min，使菌液侵入培养基。

6)培养将牛肉膏蛋白胨培养基倒置于37℃恒温箱中培养24h.将PDA培养基倒置于24℃恒温培养箱中培养3天.7)挑菌落将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌种接种到上述两种培养基斜面上，置于37℃恒温箱中培养，若发现有杂菌，还需进行一次分离、纯化、直到获得纯培养。

2. 平板划线分离1)倒平板按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔表明培养基名称、水样编号和实验日期。