临床生物样品分析技术组员：陈昆曹睿罗恒丽朱玲一. 常用临床生物样品常用生物样品的种类、特点与采集血浆(plasma)•血样——血清(serum)全血(whole blood)•尿液(urine)——用于药物剂量回收、药物肾清除率及生物利用度的研究※尿液药物浓度变化大，应测定一定时间内尿中药物总量。

※尿液与血液中药物的相关性差。

※尿中药物大多呈缀合状态。

•常用生物样品–常用生物样品的种类、特点与采集•唾液(saliva)——用于药物浓度监测和药代动力学研究•其他——动物脏器组织匀浆等–样本的代表性——力求取样条件标准化–样品的贮存•血样—离心，冷冻保存•尿液－立即测定，否则应冷藏或加防腐剂二.生物样品的常用分析技术体内药物分析是借助于现代化的仪器与技术来分析药物在体内数量与质量的变化，以获得药物在体内的各种药代动力学参数、代谢方式、代谢途径等信息。

目前，用于生物样品分析的技术有很多，归纳起来主要有以下几类方法：生物样品的常用分析方法1. 色谱分析法2. 光谱分析法3. 免疫分析法4. 微生物分析法5. 电化学分析法（一）色谱法(chromatography)一种物理或化学的分离分析方法，其分离原理主要是利用物质在流动相和固定相中的分配系数，或吸附能力的差异而达到分离。

包括薄层色谱(TLC)，纸色谱(PC)，凝胶色谱，气相色谱(GC)和液相色谱(LC)。

1.薄层色谱法（thin layer chromatography ）是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。

根据不同的分离机制，薄层色谱法可分为吸附薄层色谱、分配薄层色谱、离子交换薄层色谱和凝胶薄层色谱法等。

1.薄层色谱法（thin layer chromatography ）分离速度快优点检出灵敏度高选择性好显色方便等缺点：对生物高分子分离效果不甚理想。

2.薄层扫描法(TLCS)系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分值用于药品的质量检查的方法。

与高效液相色谱法相比，具有多通道效应，可同时平行分离分析多个样品；流动相用量少且选择范围宽、更换方便；固定相为一次性使用，对样品的预处理要求不高等优点。

已成为薄层色谱常用的定量方法，在体内药物分析中广泛应用。

3.气相色谱法(gas chromatography，GC)定义：以气体为流动相的的色谱法称为气相色谱法。

分类：按固定相的聚集状态：GSC、GLC按分离原理：GSC属于吸附色谱、GLC 属于分配色谱按色谱操作形式：填充柱气相色谱、毛细管柱气相色谱。

3. 气相色谱法(gas chromatography ，GC)优点：1.效能高，n eff 可达103-106。

2.灵敏度高，检测限可达纳克级或更低。

3.选择性高，固定相对性质极为相似的组分，如烃类异构体等有较强的分离能力。

4.分析速度快，一般的气相色谱分析一次仅需几分钟。

5.应用范围广气相色谱法广泛应用于气体和易挥发性物质或可转化为易挥发性物质的生物样品的定性和定量分析。

3.气相色谱法(gas chromatography，GC)缺点：要求被测药物及其代谢物必须具有一定的挥发性和热稳定性。

解决方法：固定相发展和衍生化试剂的广泛使用，使生物样品不再受限制。

该方法简便、快速、准确，检出限低，适合中毒病人血液中溴氰菊酯含量的测定。

4.高效液相色谱法定义：以经典液相色谱为基础，以微粒型填料作固定相，采用高压送液泵和各种高灵敏度检测器。

分离效能高检测灵敏度高分析速度快选择性好优点4.高效液相色谱法有“柱外效应”。

在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。

高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。

缺点4.高效液相色谱法分类方法5.胶束电动毛细管色谱(MECC)在MECC体系中存在着以胶束形式存在的准固定相和作为载体的液体流动相，胶束带电荷在电场的作用下产生泳动，溶质中各组分依据其在水相和胶束相之间的分配差异及在电泳和电渗流驱动下出现淌度差异而分离。

优点：手性拆分常用的分离模式之一，只需在背景电解质中添加手性选择剂，构建手性环境，即可进行手性拆分，本法适用于拆分人体内的氨基酸。

6.涡流色谱技术(TFC)涡流色谱技术是利用大粒径填料使流动相在高流速下产生涡流状态，从而对生物样品进行净化与富集。

优点:可以在线处理生物样品，速度快、选择性好、灵敏度高，易于实现自动化，近年来在生物领域尤其是体内药物分析中得到了广泛的应用。

（二）光谱法(Spectroscopy)光谱法是基于检测能量（电磁辐射）作用于待测物质后产生的辐射信号或所引起的变化的分析方法。

特点应用于体内药物分析的光谱法：比色法（COL）紫外分光光度法（UV）荧光分析法（Fluorescence method）原子吸收分光光度法（AAS）1.比色法（COL）属于吸收光度法定量依据---Lambert-Beer定律A=ECL物质在一定波长处的吸收度与其浓度成正比。

比色法仅用于少数药物浓度高，干扰成分少的生物样品的测定。

比色法：主要用于药物监测和人群代谢分型的测定，逐渐被现代色谱分析方法所取代。

紫外分光光度法（UV）（略）2.荧光分析法（Fluorescence method）利用物质经光照射后能发射荧光的特性进行分析的光学分析法。

优点：1.灵敏度高。

检出限可达10-10g/ml~10-12g/ml。

2.选择性好。

按标记物的种类按是否加入分离剂放射法免疫分析酶免疫分析法化学发光酶免疫分析法荧光免疫分析法均相免疫分析---EMIT、FPIA 非均相免疫分析RIAEIACLIAFIA方法分类1.常规荧光分析法• 1.直接测定法•适于自身能产生荧光的物质，因荧光性质与溶液的pH有关，故荧光强度的测定须在适宜的pH介质中进行。

2.间接测定法将无荧光或弱荧光物质衍生化，测定衍生物荧光强度的方法。

2.胶束增溶增敏荧光分析法•利用胶束溶液对荧光物质的增溶、增敏和增稳作用，大大提高荧光分析法的灵敏度和稳定性。

用β-CD单分子胶束荧光技术检测秦艽中龙胆苦苷血药浓度。

龙胆苦苷嵌入β-CD的疏水空洞中，使其在胶束中溶解度增加和相互碰撞几率减少，荧光量子效率提高，从而提高检测灵敏度。

3.荧光探针分析法使用荧光探针从无荧光的药物制备有荧光的衍生物。

优点：•增强待分析物质的荧光响应，提高检测灵敏度和选择性。

•稳定分析物，尤其针对活泼的和有挥发性的化合物。

•有助于化合物基团的确证。

4.荧光淬灭分析法待分析的物质能使某种荧光化合物的荧光淬灭，通过测量荧光化合物荧光的下降，间接测量该分析物质。

按标记物的种类按是否加入分离剂放射法免疫分析酶免疫分析法化学发光酶免疫分析法荧光免疫分析法均相免疫分析---EMIT、FPIA 非均相免疫分析RIAEIACLIAFIA方法分类1.放射免疫分析法(radioimmunoassay)原理:放射性标记抗原和未标记抗原（待测物）与不足量的特异性抗体竞争性地结合，反应后分离并测量放射性而求得未标记抗原的量。

优点：灵敏度高；特异性强、取样量少，适用于大批量样品的测定缺点：需要用放射性同位素标记抗原，其放射性对操作人员的健康、对环境的污染都会造成危害。

有时会出现交叉反应、假阳性反应。

需要有专用的同位素实验室及免疫测定仪器。

2.酶免疫分析法（enzyme Immunoassay）•酶免疫法分为：均相EIA；非均相EIA。

原理：将特异的抗原-抗体免疫学反应和酶催化反应相结合，以酶促反应的放大作用来显示初级免疫反应。

3.化学发光免疫分析（CLIA）是将高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，借以检测超微量物质的一种分析技术。

化学发光免疫分析包含两个部分，即化学发光系统和免疫反应分析系统。

化学发光分析系统：经催化剂的催化和氧化剂的氧化→激发态的中间体→光子→发光信号→光量子产额。

免疫反应系统：类似于抗原与抗体按发光剂不同分为:1.直接化学发光物质标记法（CLIA）发光剂直接标记抗体，多用吖啶酯类和苯酚类化合物。

2.化学发光酶免疫分析法（CLEIA）以催化反应的酶为标记物，抗原抗体结合后，其中的酶可对发光体系产生催化作用，产生发光效应。

多用的发光体系是HRP-鲁米诺。

3.电化学发光免疫分析法（ECLIA）电化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量定性。

（四）微生物测定法（microbiologicalanalysis，MA）为生物检定法，它是利用药物（常为抗生素）对于微生物的抑制或杀灭作用，通过选择对药物敏感的试验菌，在适当的条件下，根据培养基上所产生的抑菌圈的大小来测定药物效价的方法。

通过研究抑菌圈直径与抗菌素浓度的关系来测定生物样品中药物浓度。

微生物测定法•微生物测定方法稀释法比浊法扩散法稀释法一般是在一系列的试管中用液体培养基逐管稀释，于每个试管中加入相同量的对该抗生素有高度敏感的试验菌液，培养后，观察能抑制细菌生长的最低抗生素浓度作为测定终点，再与同法测定的抗生素标准品的终点作比较，从而计算供试品的浓度。

稀释法将抗生素标准品的稀释液和供试品的稀释液分别加入试管中，加入已接种试验菌的液体培养基，根据抗生素的浓度不同，实验菌受抑制的程度也不同，因而产生不同程度的浑浊，从而计算出供试品的效价。

又叫琼脂扩散法，它是以琼脂作为固体培养基，利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，将标准品溶液与供试品溶液加到接种了敏感菌的同一培养基上，恒温培养一定的时间，比较标准品与供试品对试验菌所产生的抑菌圈的大小，计算出供试品的浓度。

微生物测定方法•使用范围：一般用于抗生素，也可用于某些抗癌药物、维生素和氨基酸等的测定。

优点：具有灵敏度高、需样量较小、无需特殊设备的优点，不但适用于较纯的原料药物、制剂，也适用于经过简单提取分离的生物样品的分析。

缺点：操作步骤多、测定时间长、误差较大。

（五）电化学分析法是一类基于电池内发生电化学反应而建立的分析方法。

一般是根据待测物溶液的电化学性质，选择适当的电极组成化学电池，通过测定电信号强度或其变化对被测组分进行定性定量分析。

由于受到方法灵敏度和选择性的限制，在体内药物分析中应用不多。

谢谢！。