一、方法特异性
方法的特异性(specificity) ——又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用
——系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力
专属性——表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有的 选择性 ——系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区 分(分离)的能力 特异性——涵盖二者，以验证所测定的物质与待测药物的同一性 考察一个分析方法是否具有特异性。
生 物 样 品 的 处 理 方 法
湿法破坏
常用试剂：硝酸或硝酸-高氯酸. 特点：破坏能力强、反应激烈，无机 金属离子为高价态. 应用：适用于血、尿、组织等生物样 品的破坏.
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
生 物 样 品 的 处 理 方 法
干法破坏
高温炉高温破坏
应用——适合人发样品的破坏
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
生 物 样 品 的 处 理 方 法
氧瓶燃烧法
应用——血浆、人发中卤素、硫、硒等 血浆：血浆1ml分次点于无灰滤纸上60℃ 烘干,按规定折叠后固定. 人发：洗净、干燥（60℃ ~ 80℃）剪碎, 称取0.1 ~ 0.3g置无灰滤纸,按规定 折叠固定.
第五章 药物定量分析与分析方法验证
②液-固提取法（固相萃取法）
原理： 将不同填料作为固定相装入微型小柱， 当含有药物的生物样品溶液通过时，由 于受到吸附、分配、离子交换或其它亲 和力作用，药物或杂质被保留在固定相 上，用适当溶剂清洗杂质，再用适当溶 剂洗脱药物。
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
生 物 样 品 的 处 理 方 法
含羟基、羧基、氨基和巯基药物
+ 葡萄糖醛酸→葡萄糖醛酸苷缀合物
含酚羟基、芳胺和醇类药物
+ 硫酸→ 硫酸酯缀合物
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
生 物 样 品 的 处 理 方 法
常用方法:
酸水解:盐酸
酶水解: 葡萄糖醛酸苷酶
硫酸酯酶 葡萄糖醛酸苷酶-硫酸酯酶
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
空白血清在pH2、pH7和pH13缓冲液中乙 醚提取，提取液用RP-HPLC(UV)测定，碱 性(pH13)下提取液的杂质峰最少
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
空白血清乙醚提取物的HPLC色谱图 生 物 样 品 的 处 理 方 法
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
生 物 样 品 的 处 理 方 法
(4)化学衍生化
化学衍生化目的 ①使药物变成具有能被分离的特性 ②提高对样品的检则灵敏度 ③增加药物的稳定性 ④提高对光学异构体的分离能力
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
生 物 样 品 的 处 理 方 法
（5）有机破坏
方法：湿法破坏
干法破坏
氧瓶燃烧法
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
（1）去除蛋白质(血样)
生 物 样 品 的 处 理 方 法
①加与水混溶的有机溶剂 —蛋白质分子内和分 子间氢键发生改变. (乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃) ②加中性盐—蛋白质脱水. (饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、
磷酸盐及枸橼酸盐等)
③加强酸 — 与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀
( 10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等)
④加含锌盐及铜盐的沉淀剂—与蛋白质阴离
子形成不溶性盐沉淀. (CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH) ⑤酶解法—枯草菌溶素.适用于酸不稳定及蛋白 结合牢固药物.
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
生 物 样 品 的 处 理 方 法
（2）缀合物的水解(尿样)
生物样品定量分析方法验证内容与基本要求 1．特异性——避免干扰 2．标准曲线与线性范围——覆盖所有浓度范围 3．准确度——与实际状况相符
4．精密度——结果可重现
5．定量限——达到峰浓度的1/10～1/20
6．稳定性——确保所有样品准确测定
7．提取回收率——确保准确度
第五章 药物定量分析与分析方法验证
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第五章 药物定量分析与分析方法验证
二、标准曲线与线性范围
标准曲线（standard curve）—— calibration curve or working curve ——生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性（比例的程度）
——通常用回归分析方法所得的回归方程来评价
——除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式 ——回归分析法为最小二乘法（least squares） 或加权最小二乘法（weighted least squares） 线性范围（linear rang）——标准曲线的最高与最低浓度的区间 ——模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度
生 物 样 品 的 处 理 方 法
（3）分离纯化与富集
①液-液萃取法
水相pH值是萃取成功的关键 水相最佳pH值
碱性药物：高于pKa值12个pH单位
酸性药物：低于pKa值12个pH单位
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
生 物 样 品 的 处 理 方 法
但生物样品宜在碱性或近中性提取 ——生物基质中内源性物质多为酸性， 在碱性下不易萃取
第五章 药物定量分析与分析方法验证
第五章 药物定量分析与分析方法验证
第一节 定量分析样品的前处理方法
第二节 定量分析方法的特点 第三节 药品分析方法的验证
第四节 生物样品分析方法的基本要求
第五章 药物定量分析与分析方法验证
生物样品分析的特点
1．干扰物质多——生物样品中含有大量的内源性物，如质蛋白 质、脂肪等，以及代谢物、结合物等干扰分能重复取样——生物样品多数在特定条件下采
集，无法再次取样
3．被测成分浓度低——对分析方法的灵敏度及专属性要求较高
第五章 药物定量分析与分析方法验证
体内分析方法要求
1. 检测方法的高灵敏度—最低检测量10-9~10-7g或10-15~10-12g 2. 分离方法的高选择性、高专属性 为满足各项要求，最常用的分析方法有 1 ） 色 谱 法 ——GC 、 HPLC 、 HPCE （ highperformance capillary electrophoresis） 2）免疫分析法——RIA、EIA 3）联用技术——GC-MS、LC-MS