Affinity chromatography
Possible elution strategies:
pH Ion strengh Denature Competitor ligand or analog
Ni-NTA columns
The high affinity of the Ni-NTA resins for 6xHis-tagged proteins or peptides is due to:
Na+
Na+ Na+ Na+
Na+ -
+
Cl-
+
Increased salt concentration
基本操作过程
1. 样品制备，装柱与平衡
2. 上样（样品溶解于A液中）
3. 洗脱：穿透峰，洗脱峰 4. 收集、鉴定
离子交换层析有两种洗脱方式
分步洗脱：用间断地递增的不同离子强度的流动
相分次洗脱样品蛋白的方法；
chrome意为“色彩”，graphy源自希腊文，意为 “写”。“层析”就是“色谱” 。 层析最早由俄国植物学家 Цвет 于1903年创造， 1941年英国学者Martin和Synge提出分配层析， 此后这种方法得到很大的发展。 层析是利用物质在固定相与流动相之间不同的分 配比例，达到分离目的的技术。
白的纯化；
通过免疫亲和层析技术，只需一步，即可纯化带 有标签的目标蛋白。
亲和层析的优点
1. 高效与简便：一旦固定化配体制备好后，操作使 用非常方便； 2. 亲和层析是高度浓缩的过程； 3. 可从样品中去除大量杂质； 4. 可在活性物质中去除理化性质几乎完全相同的但 已失活的那些“杂质”。
亲和层析中的三大通用技术
分离的蛋白质混合物的Mr范围，如Sephadex G-50
的分离范围是1500～30000。 常用的凝胶有Sephadex、Sepharose、Sephacryl、 Superdex等。
Size-exclusion chromatography
Size-exclusion chromatography
Absorbance at 280 is used to identify protein-containing fractions. You can also perform an enzyme specific assay.
凝胶过滤的注意事项
1. 要根据待分离物质的分子量，选择特定的凝胶过 滤基质； 2. 凝胶过滤层析不仅可用于亲水性分子的分离，也 可用于疏水性分子的分离，当用于疏水性分子分 离时，该类层析往往被称为“凝胶通透层析”； 3. 凝胶过滤层析可提供样品的分子量信息； 4. 凝胶过滤的上样量一般在柱床体积的1～5％； 5. 凝胶过滤的样品浓度越大越好，但一般不要超过 100mg/ml。
3- Elute
2- Wash away non bound sample components from solid support
Affinity chromatography
Commonly used affinity columns:
Ni2+ binds to poly Histines (example 6xHis) Specific antibodies (anti-Flag tag) glutathione binds to GST Protein A or G binds antibodies
固定相：固定相是层析的基质。通常是固体（如
吸附剂，凝胶，离子交换剂等），能与待分离的
化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。
流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的 物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为 流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时
称为展层剂。
按操作形式不同分类：
柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移 动而达到分离。 纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相 展开，以达到分离鉴定的目的。 薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层 析类似的方法进行物质的分离和鉴定。 纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检 测分析和少量分离制备，通常为一次性使用； 柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。 生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和 层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。
可溶性：硫酸铵沉淀 等电点：离子交换层析 分子大小：凝胶过滤层析 生物学性质：亲和层析
蛋白质纯化的基本设计原则
原料应易得到，并尽可能富含目的蛋白； 应有特异性的蛋白质检测方法（最重要的因素， 决定了纯化能否成功）； 分级分离，先粗后细； 纯化条件尽量温和，避免蛋白失活。
若干区带。
稳态电泳：蛋白质迁移一段时间后达到稳态，带
的宽度不再随时间而改变。
1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳
凝胶由丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（bis） 经共聚合而成，此过程在TEMED和过硫酸铵催化 下进行。 Acr在AP和TEMED的作用下形成单链，随后通过 bis的作用交叉互联形成网状结构，聚合成凝胶。 凝胶的孔径可在较宽范围内变化，以迎合不同的分 离需要。
梯度洗脱：连续改变流动相离子强度的方法。 目前随着层析的自动化，梯度洗脱成为大多数情
况下的首选方案。
分步洗脱分子量不同的蛋白质，通过凝胶分子筛时速度 不同来分离蛋白质的方法。
固定相：凝胶颗粒（gel bead），多孔的网状结构，
其网孔决定了凝胶的分级分离范围，即能被该凝胶
反向层析，或称反相色谱，reverse phase chromatography，是液相色谱分析中最常用的 技术。 当反相色谱用于蛋白质分离时，其原理与疏水层 析基本相同，区别在于： ① 疏水层析的配基疏水性较弱（苯基等），所 以高盐吸附，低盐洗脱； ② 反相色谱配基疏水性强（C18等），所以需要 使用有机溶剂洗脱。
蛋白质的检测方法
蛋白质的活性检测方法：必须快，必须是特异
性的
蛋白质的免疫学检测方法：western-blot，前提
是有特异的抗体
分离纯化的一般程序
1. 前处理（取决于采用的材料）
动物材料处理：剔除结缔组织和脂肪组织
种子处理：去种皮，有机溶剂脱脂
动物细胞破碎：匀浆器、超声波处理 植物组织：研磨，纤维素酶 细菌破碎：超声波，溶菌酶 如果蛋白质定位于某一细胞器，可用差速离心法 将其分离。
3. 亲和层析
以样品的生物活性为依据的分离方法。生物分子的 特点是有专一的活性，如酶与底物的结合，抗原与 抗体，激素与受体，糖与凝集素……等。
将上述作用体系的一方连接到层析基质上，使之固
定化，就有可能分离纯化专一作用的另一方。
Affinity chromatography
Makes use of specific binding interactions between molecules 1- Incubate crude sample with the immobilized ligand
其它杂蛋白分离开来。
常用方法：盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分
离等
特点：简便、处理量大、既能除去大量杂质（包
括脱盐），又能浓缩蛋白质溶液。
3. 细分级分离（fine fractionation） 主要方法： 层析：凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲
和层析等
1. 蛋白质的层析分离
层析（chromatography）
怎样纯化蛋白质？
生化学家根据特定蛋白质与其他蛋白质的性质差 异，来分离或纯化它。 可溶性、等电点、分子大小、生物学性质……
可溶性：硫酸铵沉淀 等电点：离子交换层析 分子大小：凝胶过滤层析 生物学性质：亲和层析
1. 离子交换层析
离子交换层析利用物质的电荷与层析载体（离子 交换剂）电荷之间的相互作用而达到分离纯化的 目的，属于吸附层析。 离子交换层析的固定相称为离子交换剂，由基质 和基团两部分组成。
相对离心力/×g 1 000 4 000 15 000 30 000 100 000
时间/min 5 10 20 30 3～10 h
沉降的组分 真核细胞
叶绿体、细胞碎片、 细胞核 线粒体、细菌 溶酶体、细菌细胞 碎片 核糖体
2. 粗分级分离（rough fractionation）
获得蛋白质提取液后，用一定方法，将蛋白质与
① 基质：纤维素、琼脂糖、葡聚糖、苯乙烯-二 乙烯苯等高分子聚合物；
② 基团：共价结合在基质上的带电基团，可分 为正电基团和负电基团。
Ion-Exchange chromatography
+ +
If pH mobile phase =7.2
Then charge of the proteins: (-) (-) (+) (+)
蛋白质具有亲水与疏水两重性，如果在层析基质 上接上疏水的基团，就能在一定条件下与某些蛋
白质的疏水基团相互作用，使之吸附，而达到分
离纯化的目的。
一般情况下，是高盐吸附（1～2M 硫酸铵），降
低流动相的盐浓度，使样品洗脱。 疏水层析的机制与离子交换层析正好相反，因此 两者是互补的。
反向层析与疏水层析原理相同
反相色谱分离蛋白质的原理
反相色谱是最高效的蛋白质层析技术之一
2. 蛋白质的电泳分离
电泳（electrophoresis）
带电粒子在电场中向与自身电荷相反的电极移动 的现象称为电泳。 蛋白质是两性电解质，在不同pH溶液中带不同电 荷，在直流电场中能够泳动。
电泳基本原理
蛋白质在电场中泳动时，受到两种方向相反的力 的作用： 电场力 F＝qE，q为带电量，E为电场强度 摩擦力 Ff＝fv，f为摩擦系数，v为迁移速度 当蛋白质以恒速运动时，F－Ff＝0，即qE＝fv， 此时：v/E＝q/f＝q/6r