化
学进展
第２０卷
链内二硫键，而且包含一对邻位的半胱氨酸（Ｃｙｓ
Ａ６，Ｃｙｓ
Ａ７）。１９６０年，Ｍｏｏｒｅ等¨引完成牛胰核糖核
酸酶（ＲＮａｓｅ）全序及二硫键分析。该酶含有１２４个氨基酸，４个链内二硫键。这些早期的研究确立了如今仍在使用的二硫键定位研究的基本思路，包括：（１）将样品蛋白在避免二硫键重排或交换的条件下，尽可能地在其所有半胱氨酸残基之间断裂而形成二硫键相连的肽段；（２）分离这些肽段混合物；（３）鉴定分离所得的各个肽段；（４）断开肽段中的二硫键；（５）分析断开二硫键后的肽段，与整个氨基酸序列比较，推断二硫键的位置。同时这些早期的研究也提供了很多相关实验条件的经验¨７＿２１｜。比如强酸的环境会促进二硫键的重排，在弱碱性条件下进行酶切时也会产生二硫键的交换，因此要小心地控制裂解实验条件。后来又有许多关于二硫键在碱性ｐＨ条件下交换反应增强的报道ｍ一划。但是在酸性条件下蛋白构象趋于展开从而更容易在半胱氨酸残基之间断裂，所以提议采用酸水解或胃蛋白酶（ｐｅｐｓｉｎ）酶解ｈ９’死训。酸水解法特异性不强，对较大蛋白和肽不合适。胃蛋白酶可以在酸性条件下使用，其专一性较低，断裂位点多，所以也更容易在半胱氨酸残基之间断裂，生成的含二硫键肽段比较小，有利于后面的分离和鉴定。
（１．ＣｈａｎｇｃｈｕｎＣｅｎｔｅｒｏｆＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＣｈａｎｇｃｈｕｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｐｐｌｉｅｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２２，Ｃｈｉｎａ；２．ＧｒａｄｕａｔｅＳｃｈｏｏｌｏｆｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆ
收稿：２００７年７月，收修改稿：２００７年９月
＊国家自然科学基金项目（Ｎｏ．３０６７２６００，２０６７５０７９）资助
＊＊通讯联系人ｅ．衄ｉｌ：ｓｙｌｉｕｌ９＠ｙａｈｏｏ．ｔｏｍ．ｃａ
硫键还将有助于我们进一步揭示蛋白的高级结构及其生物功能¨“，指导定向化学合成和审评基因工程重组蛋白的折叠¨２叫引，便于Ｘ射线晶体衍射法（ｘ．
第２０卷第６期２００８年６月
化
学进展
ＰＲＯＧＲＥＳＳＩＮＣＨＥＭＩＳＴＲＹ
Ｖ０１．２０Ｎｏ．６Ｊｕｎｅ，２００８
蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析＊
仇晓燕１’２
崔
勐１
（１．中国科学院长春应用化学研究所长春质谱中心
刘志强１
刘淑莹Ｈ‘
长春１３００２２；２．中国科学院研究生院
北京１０００３９）
摘
要
二硫键是一种常见的蛋白质翻译后修饰，对稳定蛋白质的空间结构，保持及调节其生物活性有
ｒａｙ
ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）的三维结构研究¨纠以及为通过核
磁共振波谱法（ＮＭＲ）正确解析溶液中的构象奠定基础㈨。
当蛋白质分子中存在二硫键时，在完成其氨基酸测序分析后，需要对二硫键的位置加以确定。１９５５年Ｒｙｌｅ等【１７’坞３对胰岛素二硫键结构的分析是蛋白质化学研究史中的里程碑。胰岛素分子的Ａ、Ｂ两链通过两个链间二硫键连在一起，Ａ链还有一个
中图分类号：０６５７．６３；Ｑ５１
文献标识码：Ａ文章编号：１００５．２８１Ｘ（２００８）０６．０９７５—０９
ＰｒｏｔｅｉｎＤｉｓｕｌｆｉｄｅＢｏｎｄＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄＩｔｓＡｎａｌｙｓｉｓｂｙＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ
Ｑｉｕ
Ｘｉａｏｙａｎｌ＇２
ＣｕｉＭｅｎ９１Ｌｉｕ劢ｉｑｉａｎ９１ＬｉｕＳｈｕ乒ｎ９１‘‘
ａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆｂｅｉｎｇｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅ．Ｓｏｍｅｕｓｅｆｕｌｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｏｆｄｉｓｕｌｆｉｄｅ
ｂｏｎｄｓｉｎｐｒｏｔｅｉｎｓ
ａｒｅ
ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ．ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｒｎａｓｓ
ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｉｎｔｈｉｓ
着非常重要的作用。因此，确定二硫键在蛋白质中的位置是全面了解含二硫键蛋白化学结构的重要方面。在众多实验方法中，现代质谱技术因其操作简单、快速、灵敏等优点而成为分析二硫键的重要手段。本文介绍了目前主要的定位二硫键的方法以及质谱在二硫键定位分析中的应用与进展。
关键词
二硫键定位质谱串联质谱三羧乙基膦稳定同位素标记
ｏｆｔｈｅｃｈｅｍｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ
ａ
ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎｕｍｅｒｏｕｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍｅｔｈｏｄｓｈａｖｅｂｅｅｎｄｅｖｅｌｏｐｅｄｆｏｒｔｈｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ
ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄｓｉｎｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｏｄｅｒｎｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｈａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｓ锄ｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｏｌｆｏｒｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄｐａｔｔｅｒｎｓｄｕｅｔｏｉｔｓ
ｔｈｅ
ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ
ｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ
ａｎｄ
ｔｈｅｉｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．
Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ．ｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄｓｂｅｃｏｍｅｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔａｓｐｅｃｔｆｏｒｏｂｔａｉｎｉｎｇａ
ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ
ａｒｅａａｒｅ
ｒｅｖｉｅｗｅｄ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ
ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｏｆｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏБайду номын сангаасｄ；ｌｌｌ越Ｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＭＳ／ＭＳ；ＴＣＥＰ；ｓｔａｂｌｅ
ｉｓｏｔｏｐｅｌａｂｅｌｉｎｇ
１
引言
二硫键广泛存在于原核和真核生物的激素、酶、
免疫球蛋白、血浆、抑制剂和毒液等蛋白质中，是一种常见的蛋白质翻译后修饰。二硫键作为共价键交联多肽链内或链间的两个半胱氨酸，对稳定蛋白质的空间结构¨－５】、维持正确的折叠构象№’７］、保持及调节其生物活性¨－１训等都有着举足轻重的作用。因此，确定二硫键在蛋白质中的位置对于鉴定蛋白质一级结构有着重要的意义，是研究含有二硫键结构的活性多肽／蛋白质化学结构的重要方面。定位二
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００３９，Ｃｈｉｎａ）
ＡｂｓｔｒａｃｔＤｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄｓ
ａｒｅｏｎｅ
ｏｆｔｈｅｍｏｓｔｃｏｍｍｏｎｃｏｖａｌｅｎｔｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｈｅｙｐｌａｙ
ａｎ
ｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅ
ｉｎ
ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ