毕赤酵母表达系统步骤
（参考Invitrogen公司说明书）：
一、pPICZαA、B、C质粒以及DH5α菌株的保存
1取0.5μl pPICZα A、B、C质粒，热击转化DH5α，在低盐LB（含有25μg/ml Zeocin）的平板上37℃培养过夜。
2挑取转化子，甘油保存。
二、载体构建
1将目的基因构建到pPICZα载体上，转化DH5α，用Zeocin筛选转化子。
2提质粒酶切鉴定或PCR鉴定
3载体测序
测序可用α-Factor引物或5’AOX1引物，3’AOX1引物
三、线性化DNA
1提取足够量的质粒DNA（一次转化至少需要5-10μg质粒）
2 酶切线性化10μg构建好的载体，同时酶切空载体做对照，根据载体选择线性化酶切位点（样品分管酶切），pPICZα载体在5’AOX1区域有三个酶切位点可选择：SacI、PmeI、BstXI
3 取1-2μl酶切产物跑电泳，确定是否酶切完全；
4 过柱纯化线性化质粒（用50μl EB洗脱）；
四、线性化DNA的去磷酸化处理
线性化质粒43μl
CIAP Buffer 5μl
CIAP酶2μl
四、总体积为50μl的样品37℃ 1h，过柱纯化，用30μl ddH2O洗脱；
五、感受态细胞的制备
实验前准备：无抗性YPD平板一个、无抗生素液体YPD培养基，100μg/ml Zeocin YPD 平板和液体、50ml离心管两个、500ml预冷的无菌水、20ml 1M 山梨醇（灭菌预冷的），0.2cm预冷的电击杯；
1YPD平板划线培养菌，30℃培养2-3d；
250ml三角瓶中，加入5ml YPD，挑取酵母单菌落，30℃培养过夜；3吸取0.5ml菌液，加入至含有200ml新鲜YPD的1L三角瓶中，30℃，225rpm/min培养至OD值1.3-1.5；
41500g，4℃离心5min收集菌体；
540ml冰预冷的无菌水重悬沉淀；
61500g，4℃,5min；
730ml无菌水重悬；
81500g，4℃,5min；
910ml 1M 山梨醇重悬；
101500g，4℃,5min；
11加入1ml山梨醇，重悬冰上放置，直接做转化，或加入灭菌甘油每管80ul分装，冻存于-80℃(长时间保存会影响转化效率)；
六、电击转化
15-10μg线性化DNA（20μl<）与80ul上述感受态细胞混合，转移
至预冷的0.2cm电击杯中（点击条件：电压1.5kV；电容25µF；
电阻200Ω，电击时间为4～10msec）；
2冰上放置5min
3电击（按生产厂商提供的适合酵母用的参数）
4迅速加入1ml预冷的1M 山梨醇，转移至1.5ml EP管中
530℃静置培养1-2h
（如果要增加存活率，获得更多的转化克隆，可在30℃静置培养1h后，加入1mlYPD培养基，30℃200rpm培养1h后取部分涂布与不同浓度抗生素的平板）
6取50、100、200ul分别涂布于含有Zeocin的YPD平板，30℃培养2-10 d至有菌落出现；
7如果要筛选多拷贝转化子，将转化克隆混合在一起，涂布在Zeocin 浓度为500、1000、2000μg/ml的YPD平板，培养2-3d。
七、筛选鉴定
1菌液PCR鉴定
（1）英俊Invitrogen说明书方法：取10ul菌液在1.5ml离心管中，加入5μul溶菌酶，30℃10min，将产物转移至-80℃30min，
或者浸入液氮1min，取2-5ul直接做PCR检测。
（2）煮沸冻融法：1ml菌液12000rpm离心2min，收集菌体，500μl PBS重悬两次，100μl无菌水溶解，沸水浴10min，-80℃冷
冻10min，再沸水浴10min后立即涡旋震荡1min，12000rpm
离心2min取上清做PCR。
（3）P CR检测（pPICZα载体）：
X-33和GS115扩增大小2.2kb加目的片段，KM71是3.6kb
加目的片段
引物片段大小
5’AOX/3’AOX： 2.2kb加上目的片段大小
α-Factor/3’AOX： 2.3kb加上目的基因大小
2酵母基因组DNA提取
（1）取1.5ml菌液4000rpm 离心5min收集菌体
（2）沉淀用无菌水洗一次，4000rpm 5min
（3）1M山梨醇重悬，加入5ul溶菌酶，30℃温浴30min
（4）加入100ul 2% SDS，-20℃冻融震荡3次
（5）加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混匀，离心取上清（6）加入0.1倍体积3mol/L醋酸钠和2倍体积无水乙醇，-20℃静置30min
（7）离心弃上清，75%乙醇洗涤，晾干后溶于20ul无菌水中，-20℃冻存。
八、鉴定正确的重组菌株甘油保存。
Law Salt LB培养基液体pH7.5
1L 350ml液体150ml固体蛋白胨：10g 3.5g 1.5g
酵母提取物：5g 1.75g 0.75g NaCl：5g 1.75g 0.75g 琼脂粉：15g 2.25g Zeocin：25ug/ml
4℃避光保存两周
YPD
1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 葡萄糖、2% 琼脂、100ug/ml Zeocin 1L配置
酵母提取物：10g
蛋白胨：20g
琼脂：20g
高压灭菌后，加入100ml 20%的葡萄糖（过滤灭菌），冷却至60℃后加入Zeocin。
YPDS
1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 葡萄糖、1M山梨醇、2% 琼脂适当浓度Zeocin（根据菌株不同选择）
1L配置
酵母提取物：10g
山梨醇：182.2g
蛋白胨：20g
琼脂：20g
高压灭菌后，加入100ml 20%的葡萄糖（过滤灭菌），冷却至60℃后加入Zeocin。