电泳按长度分辨。 不同末端终止DNA链的长度是由掺入 到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。 由此诞生了以Sanger命名的测序原 理即双脱氧链终止法测序原理。
核酸序列形
OH
CH2
O
N
H H
H H
P OH
O
OH
3´,5CH2
O
N
H
H
H
H
P OH
O
OH
CH2
O
N
H H
H H
OH
O
5´ ´ - P OH
O
OH
3 CH2
O
N
OH（H）
磷 H 磷H 酸 核羟´苷酸酸二形成3,5-磷酸 OH
H H
OH（H）
OH
OH（H） O O
OH（H）
P
O
OH
CH2
O
N
H H
OH
H H
OH （H）
“双脱氧末端终止”的含 义
终止物标记方法
Template dNTP
Polymerase
Primer Terminator
MaxamGilbert method
Invention of Heliscope
single molecular sequencer
DNA sequencing
Invention of personal genome
machine
(1977)
Invention of
optical
mapping
system
Invention of Automated Fluorescent Sequencer
Invention of 454 GS 20 Sequencer
(2005)
Analyzer System (2006)
(1985)
1977年，英国人Fred Sanger 发现， 如果在DNA复制过程中掺入ddNTP，就会 产生一系列末端终止的DNA链，并能通过
AG CT
因为颜色不同，4种终止物可以在一起进行反应。
3730xl Sequence Map
Next-generation sequencing/Deep sequencing technology main platforms
Roche 454
Genome Analyzer/ Hiseq 2000
Next-generation sequencing technology overview
Agenda
• 测序技术简史 • 第一代测序技术 • 第二代测序技术 • 第三代测序技术
Invention of
1 测序技术简史 Single molecule real time(SMRT)
chemical degradation method by
➢ 主要缺点是无法准确测量同聚物的长度。例如当待测序列 中出现Poly(A)的情况下，测序反应中会一次加上多个T， 而加入T的数目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造 成结果不准确。因此454技术主要的错误不是来自核苷酸 的替换，而是来自插入或缺失。
Next-generation sequencing/Deep sequencing technology main platforms
Invention of Nanopore
single molecular sequencing
(Oxford Nanopore corporation)
1950 1960
Chemical degradation method by
Whitfield (1954)
1970 1980
1990 2000
进行测序。 ➢ PTP板上含有很多直径约为44 μm的小孔，每个小孔仅能
容纳一个磁珠，通过这种方法固定每个磁珠的位置以监 测接下的测序反应。
454的特点
➢ 较高的测序通量，每个循环能产生总量为400-600 Mb的 序列。
➢ 提高测序读长，长度达到400 bp，使得后继的序列拼接工 作更加高效、准确。
➢ 同时孵育体系中含有PCR反应试剂，因此可以保证每一个与磁 珠结合的小片段都会在各自的孵育体系内独立扩增, 扩增产物仍 可以结合到磁珠上。
➢ 反应完成后，破坏孵育体系并富集带有DNA的磁珠。经过扩增 反应，每一个小片段都将被扩增大约100万倍，从而达到下一步 测序反应所需的模板量。
3. 测序 ➢ 将携带DNA的磁珠与其他反应物混合物，放入PTP板中
继的扩增测序的接头A和一段含有生物素的接头B连接到 DNA片段上，会产生含有接头AA、AB、BB、BA四种 DNA片段，然后与可结合生物素的磁珠结合，其中片段 AA被洗脱掉，片段AB\BA\BB结合到磁珠上，通过变性 处理回收含有接头A和接头B的单链DNA。
2. Emulsion PCR
➢ 将这些ssDNA分别单独与水油包被的直径大约28 μm的磁珠在 一起孵育、退火，由于磁珠表面含有与接头互补的寡聚核苷酸 序列，因此ssDNA会特异地连接到磁珠上。
➢ 通过检测荧光信号释放的有无和强度，确定被测分子的序列。光信号 由CCD摄像机检测并反应为峰。每个峰的高度（光信号）与反应中掺 入的核苷酸数目成正比。
➢ 反应结束后，ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号， 并再生反应体系。
454测序流程1. 待测DNA的构建 ➢ 将基因组DNA/cDNA片段打断至400-800bp，将用于后
ABI SOLiD
Bir Pri 2005
thd Pnycroi ay2006 sSepeqlqeu 2007 enuiSnngeegcnq-ic
454测序原理
➢ 测序反应以磁珠上大量扩增的ssDNA为模板，在每一轮测序反应中， 依照T、A、C、G的顺序依次循环进入，每次只进入一个碱基。 如果这种dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。 释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化酶反应形成ATP。生 成的ATP和荧光素酶共同氧化反应体系中的荧光素分子并发出荧光。
2010
Invention of
Applied Biosystems
Development of Sanger Sequencing (1977)
Invention of Capillary Sequencer (1996)
Solid System (2007)
Invention of Illumina Genome
Roche 454
Genome Analyzer/ Hiseq 2000
ABI SOLiD
Bir Pri 2005