ＳＯＬＩＤ ３５—５０
３．０测序通量可达２０ Ｇ，而测序片段仅有 ｂｐ，这使得该技术与Ｓｏｌｅｘａ相比，应用范围
还不够广泛。ＡＢＩ公司正加快研发进度，争取在片 段长度方面做出重大突破。
ＤＮＡ水平的应用 新一代测序技术极大地推
２．１．１全基因组测序
万方数据
７８
生物技术通报Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
ａ
ｓｕｃｈ ｒｅｓｅａｒｃｈ．
ｓｎａｐｓｈｏｔ ｏｆ ｔｈｅｓｅ
ｎｅｗ
ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，ｄｉｓｃｕｓｓ ｔｈｅ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ａｎｄ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅｍ，ａｎｄ ａｌｓｏ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅ ｔｈｅｉｒ ａｐ—
ｐｌｉｅａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｆｉｅｌｄｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｈｉｒｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｅｎｏｍｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｒｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
生物技术通报
・技术与方法・
Ｂ１０ＴＥＣＨＮｏＬｏＧＹ ＢＵＬＬＥＴｌＮ
２０１０年第１０期
新一代测序技术的发展及应用前景
杨晓玲施苏华
唐恬
（中山大学生命科学院，广州５１０２７５）
摘要：Ｓａｎｇｅｒ测序的提出给人类破译遗传密码提供了强有力的工具。而近几年飞速发展起来的高通量测序技术无论 在成本还是效率上．都对传统测序提出了巨大的挑战。千元人类基因组计划的公布更是加快了测序研发的进程。通过下一 代测序技术，科学家不仅能够绘制出各个物种的基因组图谱，还能探讨不同条件下的基因表达差异以及不同物种之间或者物 种之内的序列差异。进而为传统生物学以及医学研究开辟新的视角。与此同时，随着各大测序平台的不断改进，普通实验室 都有能力承担此类大型测序项目。就目前正在发展的几种高通量测序技术进行了综合阐述，并比较了各种测序技术的优缺 点。最后对其应用领域作了 重测序
２应用与实践
Ｋａｈｖｅｊｉａｎ在２００８年的一篇综述中提到¨“： “如果你可以随心所欲地测序，你会开展哪些研 究？”。人类基因组计划的完成和近年来高通量测序 的兴起，使越来越多的科研工作者认识到，我们对于 生物界的认识才刚刚起步。基因图谱的绘制并不意 味着所有遗传密码的破解，癌症基因组的开展也没 有解决所有的医学难题。ＤＮＡ变异的模式和进化 机制，基因调控网络的结构和相互作用方式，复杂性 状及疾病的分子遗传基础等，仍是困扰生物学家和 医学家的难题，而高通量测序的广泛应用，也许可以 让我们知道的更多。
收稿日期：２０１０－０４—１２
走向一个新的阶段。
１
测序与发展
Ｓａｎｇｅｒ测序作为３０多年来惟一的ＤＮＡ测序方
法，对现代生物学研究起到了极大的促进作用。然 而随着大规模基因组学的兴起，多种高通量低成本 的测序技术应运而生，并逐步被应用到生物学研究 的各个领域。目前，新一代测序技术正以Ｓａｎｇｅｒ测 序无可比拟的 速度产生海量数据，不仅引领生命科学全面进 入后基因组时代，更推动了生物信息学、系统生物学
基金项．目：国家自然科学基金项目（３０７３０００８，３０９７０２０８，４０９７６０８１），“９７３”计划项目（２００７ＣＢ８１５７０３），中山大学莺点培育计划项目及有害生物 控制与资源利用国家重点实验室创新课题，教育部留学归国人员科研启动基金，中山大学重点培育计划 作者简介：杨晓玲，女，硕士研究生，研究方向：分子进化；Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｙｓｕｌｓｙｘｌ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ 通讯作者：唐恬．副教授，Ｅ．ｍａｒｌ：ｔｔｉａｎ．．８＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
双螺旋结构的发现，遗传密码的破解，第一个完 整基因组图谱的绘制…让科学家越来越多地认识 到测序在生物学研究中的重要作用。从１９７７年 Ｓａｎｇｅｒ和Ｃｏｕｌｓｏｎ关于快速测序技术论文的首次发 表¨’２’，到２０１０年高通量测序的广泛应用，海量遗 传信息被相继揭秘；从人类基因组计划，到人类基因 组单倍型图计划，再到人类癌症基因组及个体基因 组计划，人类对于自身的研究也日趋深入。千元基 因组计划的提出，后基因组时代的到来。势必推动测 序技术的突飞猛进，人类对于自然界的认识也必将
万方数据
２０１０年第１０期
杨晓玲等：新一代测序技术的发展及应用前景
Ｄａｎａｈｅｒ
等交叉学科的迅猛发展。
１．１
Ｍｏｔｉｏｎ公司推出Ｐｏｌｏｎａｔｏｒ¨１测序仪同
第二代测序——高通量低成本齐头并进
以高通量低成本为主要特征的第二代测序，不
样也是基于Ｃｈｕｒｃｈ小组的研究成果，但是该设备的 成本要低很多，同时用户在使用时可以根据自己的 研究目的设置不同的测序条件。而Ｃｏｍｐｌｅｔｅ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｈａｓ ｂｒｏｕｇｈｔ ｅｖｅｒ，ｔｈｅ ａｒｒｉｖａｌ ｏｆ ｈｉｇｈ—ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｌｓｏ
ｉｎ
ｏｖｅｒ
ａ
ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｂｅｉｎｇ
ｔｏ
ｄｅｃｉｐｈｅｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ．Ｈｏｗ—
ＵＳ
ｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｌｌ ａｌｌｏｗ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｔｏ
ｄｒａｗ
ａ
ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｍａｐ，ｃｏｍｐａｒｅ
ｏｕｔ
ｇｅｎｅ ｎｅｗ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ａｖｅｎｕｅ
ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ａｎｄ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ
ｏｒ
ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ
ｓｙｓｔｅｍｓ／ｇｅｎｏｍｅ—ａｎａｌｙｚｅｒ＿ｉｉｘ．ｉｌｍｎ）ｏ
１．１．２
第三代测序——单分子长片段有望实现
第二代测序技术虽然在各方面都有了较大的突
破，但是仍然建立在ＰＣＲ扩增的基础上。为了避免 ＰＣＲ扩增带来的偏差，科学家目前正在研制对ＤＮＡ 单个分子直接测序的第三代测序仪。最具代表性的 包括Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ单分子测序仪，单分子实时合成测序 法，纳米孔测序技术等。 Ｈｅｌｉｃｏｓ技术仍然是基于合成测序原理¨…，它 采用了一种新的荧光类似物和灵敏的监测系统，能 够直接记录到单个碱基的荧光，从而克服了其他方 法须同时测数千个相同基因片段以增加信号亮度的 缺陷。Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｅｅｓ公司研发的单分子实时合 成测序法充分利用了ＤＮＡ聚合酶的特性，可以形象 的描述为通过显微镜实时观测ＤＮＡ聚合酶，并记录 ＤＮＡ合成的整个过程。纳米孔测序技术［１１’１２１则是 利用不同碱基在通过纳米小孔时引起的静电感应稍 有不同，或者不同碱基通过小孔的能力各有差异，来 加以区分不同的碱基信号。
ｏｒ
ｗｉｔｈｉｎ ｓｐｅｃｉｅｓ，ａｌｌ ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｗｏｕｌｄ ｏｐｅｎ
ａ
ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｍｅｄｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ
ｔｏ ｃａｒｒｙ ｏｕｔ
ｔｉｍｅ，ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｉｇｈｌｙ—ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ，ｎｅａｒｌｙ ｅｖｅｒｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｅａｍ ｗｏｕｌｄ ｈａｖｅ ｔｈｅ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ，ｗｅ ｐｒｏｖｉｄｅ
１．２
聚合酶合成测序法Ｒｏｃｈｅ公司推出的４５４
技术开辟了高通量测序的先河。该技术通量可达 Ｓａｎｇｃｒ测序的几百倍，而成本却只有几十分之一，因 此一经推出，便受到了国际上基因组学专家的广泛 关注。４５４采用焦磷酸合成测序法Ｈ Ｊ，避免了传统 测序进行荧光标记以及跑胶等繁琐步骤，同时利用 乳胶系统对ＤＮＡ分子进行扩增，实现了大规模并行 测序。截止到２０１０年４月，已有７００多篇文献是采 用了４５４测序技术（ｈｔｔｐ：／／４５４．ｃｏｍ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ． ａｎｄ—ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ａｓｐ），对该技术是一个极 大的肯定。 Ｉｌｌｕｍｉｎａ公司推出的Ｓｏｌｅｘａ遗传分析仪是合成 技术的进一步发展与延伸。该技术借助高密度的 ＤＮＡ单分子阵列，使得测序成本和效率均有了较大 改善。同时Ｓｏｌｅｘａ公司提出的可逆终止子”１也是 该技术获得认可的原因之一。与４５４相比。Ｓｏｌｅｘａ 拥有更高的通量，更低的成本。虽然片段长度较短 仍是主要的技术瓶颈，但是对于已有基因组的物种 来说，Ｓｏｌｅｘａ理所当然成为第二代测序技术的首选。 ２００８年以来，利用该技术开展的研究大幅度上升， 报道文献达４００多篇（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／
２．１
连接酶合成测序法
２００７年ＡＢＩ公司在
Ｃｈｕｒｃｈ小组拍１研究成果的基础上推出了ＳＯＬＩＤ测 序仪。该技术的创新之处在于双碱基编码…的应 用，即每个碱基被阅读两次，因此大大减少了测序带 来的错误率，同时可以方便的区分ＳＮＰ和测序错 误。在测序过程中，仪器自动加入４种荧光标记的 寡核苷酸探针，探针与引物发生连接反应，通过激发 末端的荧光标记识别结合上的碱基类型。目前
剪切，转录本ＳＮＰ等重要信息。Ｃｌｏｏｎａｎ等旧２ ｏ利用 ＳＯＬＩＤ对小鼠胚胎于细胞分化前后的转录组进行了 比较，挖掘出不同时期特异表达的基因以及单核苷酸 多态性，阐述了分化路径中的关键因素；Ｔａｎｇ等旧列利 用ＲＮＡ—Ｓｅｑ对小鼠单个卵母细胞进行表达谱分析， 与芯片技术相比，高通量测序可以多检测到７５％的 基因表达，并且有８％一１９％的基因存在两种以上 的转录形式。 ２．２．２小分子ＲＮＡ测序小分子ＲＮＡ是一类特 殊的调控序列，在生物体内扮演着重要的角色，近几 年受到了科学界的广泛关注。传统的研究方法主要 包括正向遗传学筛选，克隆测序法，芯片技术等，而 近几年兴起的高通量测序给小分子ＲＮＡ研究带来 了新的思路。较短的序列长度虽然是目前高通量测 序难以打破的瓶颈，却正好可以覆盖小分子ＲＮＡ的 长度。科研工作者通过测序，可以预测新的ｍｉＲ— ＮＡ．研究ｍｉＲＮＡ的保守性，建立ｍｉＲＮＡ表达谱，比 较ｍｉＲＮＡ表达丰度以及发现其他非编码ＲＮＡ等。 Ｌｕ等Ⅲ１利用４５４技术对果蝇３个物种的ｍｉＲＮＡ进 行测序，结果发现ｍｉＲＮＡ和其他基因一样，也经历 着“产生”和“消亡”的过程；Ｍｏｒｉｎ等旧刮利用Ｓｏｌｅｘａ 对人类胚胎干细胞进行小分子ＲＮＡ谱带分析，共发 现了８１个差异表达的小分子ＲＮＡ，并鉴定了２３种 未报道的ｍｉＲＮＡ。 ２．３表观基因组学应用