木质素及其衍生物对酶的吸附*张夏红1,2,程贤甦1,3,丁马太2(1.福州大学材料科学与工程学院,福建福州350002;2.龙岩学院化学与材料工程系,福建龙岩364000;3.闽江学院化学与化学工程系,福建福州350010)摘 要: 研究了高沸醇木质素、高沸醇木质素酚、高沸醇木质素胺和木质素树脂对菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶的吸附性能,结果表明:这几种木质素类吸附剂都可以吸附菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶;经改性的高沸醇木质素胺和高沸醇木质素酚的吸附性能优于高沸醇木质素和木质素树脂,且吸附后的酶还能保持较高的活性,高沸醇木质素衍生物有望成为菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶的浓缩吸附剂或固定化的载体。

关键词: 木质素;吸附剂;木瓜蛋白酶;菠萝蛋白酶;吸附中图分类号: Q814.1文献标识码:A 文章编号:1001-9731(2006)10-1643-031 引 言木质素是一种天然芳香族高分子化合物,广泛存在于种子植物中。

它与纤维素、半纤维素一起,是构成植物骨架的主要成分。

在自然界中,木质素的储量仅次于纤维素,且每年都以500亿吨的速度再生。

木质素作为吸附剂是木质素高值化利用的一个新起点,可用于生化分离、环保、医疗等领域,具有广阔的前景。

木质素及其衍生物可以作为酶吸附剂。

本课题组曾以木材为原料制得可回收利用的木质素酚[1,2],这种木素酚能有效地吸附内毒素、纤维素酶和木瓜蛋白酶等生物活性物质。

最近,本课题组研究了新开发的高沸醇木质素[3~5]及其衍生物(高沸醇木质素胺、高沸醇木质素酚)和木质素树脂对菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶的吸附作用,发现经改性的高沸醇木质素胺和高沸醇木质素酚具有良好的吸附性能,而且酶被吸附后仍具有较高的活性;而木质素树脂虽对酶有一定的吸附量,但吸附后的酶活性很低。

高沸醇木质素及其衍生物有望成为菠萝蛋白酶新型浓缩吸附剂或固定化菠萝蛋白酶的新型载体。

2 实 验2.1 试剂及材料高沸醇木质素(HBS木质素)按文献[3~5]方法自制,木质素磺酸钠(广州造纸厂),菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶(广西南宁庞博生物有限公司提供),酪蛋白(分析纯,天津福晨化学试剂厂),L-酪氨酸(生化试剂,上海化学试剂公司),L-半胱氨酸(生化试剂,上海化学试剂公司),甲醛(37%,分析纯,上海化学试剂总厂),间甲酚(化学纯,上海化学试剂公司),其余试剂均为分析纯。

2.2 仪 器Spectrum2000FT-IR spectromeper(Perkinelmer公司),Cary50紫外可见分光光度计(VARIAN公司), pH S-3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂),H H-6数显恒温水浴锅(金坛市富华仪器有限公司),DF-101B集热式恒温磁力搅拌器(浙江省乐清市乐成电器厂),800型离心沉淀器(上海手术器械厂),NPCa-02氮磷钙测定仪(上海新嘉电子有限公司)。

2.3 实验方法2.3.1 高沸醇木质素胺(H BS木质素胺)的合成见文献[6]。

2.3.2 高沸醇木质素酚(H BS木质素酚)的合成见文献[6]。

2.3.3 木质素树脂的合成20g木质素磺酸钙溶于30ml蒸馏水中,加入10ml 36.3%H2SO4,搅拌30min,静置2d后取上层液体反应。

先升温至60 ,加入3g苯酚,再升温至80 反应10min,加入14g37%甲醛溶液继续反应20min,得到粘稠的反应产物,经干燥后研成细粉过50目标准筛备用。

2.3.4 吸附实验分别准确称取上述各种吸附剂各两份,每份50m g。

一份于25 下加入5m l酶溶液,慢速搅拌一定时间后离心,分别收集上清液,用相应的缓冲液定容至25m l;另一份于25 下加入5ml相应的缓冲液,其余操作如上作为参比。

用Cary50紫外可见分光光度计测定清液中酶的浓度[7]。

2.3.5 酶活力的测定溶液酶活力的测定:参照文献[8]进行。

吸附后的酶活力测定:取适量吸附酶,除加入5ml 酶稀释剂外,其余步骤同溶液酶活力的测定方法。

3 结果与讨论3.1 木质素类吸附剂的合成本实验中所用的H BS木质素是以毛竹为原料[5]1643张夏红等:木质素及其衍生物对酶的吸附*基金项目:福建省教育厅科研基金B类资助项目(JB02058);福州市引进人才特别基金资助项目(200405)收到初稿日期:2006-02-07收到修改稿日期:2006-05-29 通讯作者:程贤甦作者简介:张夏红 (1971-),女,福建龙岩人,在读硕士,师承程贤甦教授,从事高分子材料研究。

以1,4-丁二醇为溶剂制备而得的一种棕褐色物质。

它不溶于水,可溶于碱及乙醇、丙酮等有机溶剂。

由于这样的制备方法是利用醇类溶剂把纤维素与木质素分离的,因而所制得的高沸醇木质素保留更多的酚羟基,具有更高的化学活性[3~5]。

以甲醛为交联剂,使H BS 木质素与二甲胺发生曼尼希反应。

这时,胺甲基被引入到木质素酚羟基的邻位,生成了H BS 木质素胺。

用凯氏定氮法分别测定H BS 木质素胺及H BS 木质素中的氮含量为1.87/0.87,说明确有部分胺甲基已经连接到H BS 木质素的苯环上而生成H BS 木质素胺。

虽然胺甲基引入量并不多,但吸附实验表明它的性质已经发生明显的改变[6]。

在木质素的结构单元中,酚羟基对位支链的 碳原子是一个活性位置,容易与苯酚衍生物发生反应而引入苯酚基团,形成二苯甲烷型分子。

采用室温相分离的方法,由H BS 木质素与间甲酚反应,制得了H BS 木质素酚;采用差异紫外光谱法,分别测定了H BS 木质素酚和H BS 木质素的酚羟基含量为2.31/2.03[6]。

木质素磺酸钙易溶于水,不能直接用作吸附剂,因此用苯酚和甲醛与其反应形成不溶于水的树脂:先用硫酸脱去木质素磺酸钙的钙离子,继使之与甲醛进行交联反应生成木质素树脂,为一棕褐色固体,不溶于水,也难溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。

3.2 木质素吸附剂对菠萝蛋白酶的吸附分别以H BS 木质素、H BS 木质素胺、H BS 木质素酚和木质素树脂作吸附剂,考察其对菠萝蛋白酶的吸附能力。

菠萝蛋白酶用pH =7的缓冲液配成C 0=2.7mg/ml 的溶液,在25 时按2.3.4方法进行吸附实验,结果如图1所示。

从图1中可以看出,木质素及其衍生物对菠萝蛋白酶的吸附量的大小依次为:H BS 木质素胺>H BS 木质素酚>H BS 木质素>木质素树脂。

H BS 木质素胺对菠萝蛋白酶的吸附在较短时间达到平衡,而H BS 木质素和H BS 木质素酚对菠萝蛋白酶的吸附在30min后才达到平衡。

图1 吸附时间对菠萝蛋白酶吸附量的影响Fig 1Effect of adsor ption tim e on adso rption capacityo f bro melain3.3 木质素吸附剂对木瓜蛋白酶的吸附分别以H BS 木质素、H BS 木质素胺、H BS 木质素酚和木质素树脂作吸附剂,考察其对木瓜蛋白酶的吸附能力(见图2)。

木瓜蛋白酶用pH =7的缓冲液配成C 0=2.0m g/m l 的溶液,在25 时按2.3.4方法进行吸附实验,结果如图2所示。

从图2中可以看出,木质素及其衍生物对木瓜蛋白酶的吸附量的大小为:H BS 木质素胺的吸附量最大,高沸醇木质素的吸附量最小;吸附时间<30min 时,木质素树脂的吸附量大于H BS 木质素酚,但延长吸附时间之后,H BS 木质素酚的吸附量大于木质素树脂。

图2 吸附时间对木瓜蛋白酶吸附量的影响Fig 2Effect of adso rption time on adsorption capacityof papain从各吸附剂对菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶的吸附情况来看,经改性后的H BS 木质素胺和H BS 木质素酚对酶的吸附量明显大于H BS 木质素,说明引入胺基和酚羟基后的H BS 木质素衍生物对酶的吸附能力有很大的提高。

据报道,菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶每个分子中含有的氨基酸残基分别为286个[9]和212个[10],这些残基中都含有氨基、羧基和羟基等亲水基团。

而H BS 木质素则由醇解而得,保留了许多的酚羟基,经改性的H BS 木质素酚中含有更多的酚羟基,H BS 木质素胺中则同时具有酚羟基和胺基,这两种基团都能与氨基和羧基形成氢键,因此H BS 木质素及其衍生物都能吸附菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶;而超临界法制备的木质素不能吸附酶[1],也说明酚羟基对于酶的吸附是有一定作用的。

而H BS 木质素胺由于同时具有两种能形成氢键的基团,吸附性能就大大提高了。

同时吸附性能还可能与胺甲基和羟基在各自反应中引入的量有关,H BS 木质素胺和H BS 木质素酚与H BS 木质素相比,其胺甲基和羟基的含量分别增加1.87/0.87倍和2.31/2.03倍,其达到吸附平衡的时间也就缩短了。

据报道,酶通常可以非共价键被吸附在固体表面,如以氢键、静电或疏水相互作用进行吸附[9]。

木质素结构中的疏水部分也可能与酶蛋白结构中的疏水基团相连接,因此可以预测木质素及其衍生物对于酶的吸附是一个复杂的过程,可能还包含了氢键吸附和疏水吸附两种形式。

3.4 吸附前后的酶活按2.3.5方法检测菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶在吸附前后的活性变化,结果示于表1及2。

表明菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶被吸附在木质素吸附剂上时都还有活性,活性收率大小的顺序均为:H BS 木质素胺>1644功 能 材 料2006年第10期(37)卷H BS 木质素酚>H BS 木质素>木质素树脂。

菠萝蛋白酶结构中巯基、氨基、色氨酸残基和组氨酸残基是酶催化活性必需基团,而羧基和羟基与酶活性无关。

而木瓜蛋白酶中至少有3个氨基酸残基存在于酶的活性部位,它们是半胱氨酸-25、组氨酸-159和天东氨酸-158,其中半胱氨酸-25的自由巯基对维持酶的活性是至关重要的;当其被氧化成-S -S -或-SO 2H 、-SO 3H ,或者当它与重金属离子结合时,则酶活力被抑制。

表1 吸附前后菠萝蛋白酶酶活性的变化Table 1Bromelain activities before and after adsorption吸附剂H BS 木质素H BS 木质素酚H BS 木质素胺木质素树脂吸附前(U /g ) 5.37 105 5.37 105 5.37 105 5.37 105吸附后(U /g ) 3.12 105 3.81 105 4.59 1050.97 105酶收率(%)58.170.985.518.1表2 吸附前后木瓜蛋白酶酶活性的变化T able 2Papain activities before and after adsorption吸附剂H BS 木质素H BS 木质素酚H BS 木质素胺木质素树脂吸附前(U /g ) 1.83 105 1.83 105 1.83 105 1.83 105吸附后(U /g )0.70 1050.94 105 1.46 1050.35 105酶收率(%)38.151.180.019.1因此,只要在吸附时没有破坏这些保持酶活性的必需基团,酶活性就不会受到影响[6]。