样品终点稀释倍数 工作参考品终点稀释倍数
（5）TF-1 细胞 TF-1 细胞株用完全培养基于 37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，控制细 胞浓度为每 1ml 含 1.0×105～5.0×105 个细胞，传代后 24 小时用于 NGF 生物学活性测定。 标准品溶液的制备 取鼠神经生长因子生物学活性测定的国家标准品， 按说明书复溶后， 用基础培养液稀释至每 1ml 含 100U(每步稀释不超过 10 倍)。在 96 孔细胞培养板中，做 3 倍系列稀释，共 8 个稀释度，每个稀释度做 2 孔，每孔分别留 100μl 标准品溶液，弃去孔中 多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。 供试品溶液的制备 将供试品按标示量复溶后，用基础培养液稀释至每 1ml 约含
附录Ⅹxx 鼠神经生长因子生物学活性测定法 第一法 鸡胚背根神经节培养法 试剂 （1）鼠尾胶 大鼠鼠尾用 75%酒精消毒后，分离出尾腱，剪碎，浸泡于 0.1%
冰醋酸溶液中溶解 48 小时，4℃、4000 转/分钟离心 30 分钟，取上清液，经 121℃、15 分 钟灭菌，-20℃保存。 （2） DMEM 培养液 取市售 DMEM 培养液， 加入终浓度为 100Iu/m1 青霉素、 100Iu/m1 链霉素和 2mmol/L L-谷氨酰胺，混匀。 （3）基础培养液 量取胎牛血清（FBS）10ml，加 DMEM 培养液 90ml，4℃保存。 标准品溶液和供试品溶液的制备 取注射用鼠神经生长因子生物学活性测定的国家标 准品，用 DMEM 培养液做 3 倍系列稀释，共 5~6 个稀释度。取已过滤除菌的供试品做相同 稀释。 测定法 取 7~9 天的鸡胚，无菌条件下取出背根神经节，分置于涂有鼠尾胶的培养瓶 中，贴壁 1~2 小时后，加入不同稀释度的标准品溶液和供试品溶液，并设阴性对照瓶，于 37℃、含 5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养 24 小时，用倒置显微镜观察神经节轴突生长情 况，以引起++++生长的最高稀释度为判定终点，用下式计算样品的生物学活性单位。 样品的活性单位(AU/ml)＝工作参考品活性× 【附注】神经节轴突生长判定标准 “#” 神经节生长过量抑制； “++++”：神经节突起长满四周，又长又密，呈树杈状； “+++”：神经节突起长满 2/3 周，呈树杈状； “++”：神经节突起长满 1/2 周； “+”：神经节突起只有几根； “－”：无突起生长。 第二法 TF-1 细胞/MTS 比色法 本法系依据人红细胞白血病细胞 （简称 TF-1 细胞） 的生长状况因鼠神经生长因子 （NGF） 生物学活性的不同而不同，以此检测 NGF 的生物学活性。 试剂 （1）RPMI 1640 培养液 取市售 RPMI 1640 培养液，加入终浓度为 100Iu/m1 青霉素和 100Iu/m1 链霉素。 （2） 基础培养液 量取胎牛血清 （FBS） 100ml， 加入 RPMI 1640 培养液 900ml 中。 4℃ 保存。 （3）完全培养液 基础培养液添加鼠神经生长因子至终浓度为每 1ml 含 12U。 （4）MTS 溶液 取市售的 MTS 于 4℃融化，1.2ml/支分装到 EP 管中， ，并避光保存于 -20℃。
100U(每步稀释不超过 10 倍)。在 96 孔细胞培养板中，做 3 倍系列稀释，共 8 个稀释度，每 个稀释度做 2 孔，每孔分别留 100μl 标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件 下进行。 测定法 TF-1 细胞株用完全培养液于 37℃、 5％二氧化碳条件下培养， 控制细胞浓度为 每 1ml 含 1.0× 105~5.0× 105 个细胞，传代后 24 小时用于生物学活性测定。将试验所用溶液预 温至 37℃。取足量 TF-1 细胞培养物，离心收集 TF-1 细胞，用基础培养液洗涤 3 次，然后 重悬于基础培养液配成每 1ml 含 6.0× 104 个细胞的细胞悬液，置于 37℃、5％二氧化碳条件 下备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的 96 孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液 100μl， 于 37℃、5％二氧化碳条件下培养 66～72 小时。每孔加入 MTS 溶液 20μl，于 37℃、5％二 氧化碳条件下培养 3 小时。以上操作在无菌条件下进行。放入酶标仪，以 550nm 为参比波 长，在波长 490nm 处测定吸光度，记录测定结果。 试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算结果： 供试品生物学活性（U/ml）=Pr×
Ds Es Dr Er
式中 Pr 为标准品生物学活性，U/ml； Ds 为供试品预稀释倍数； Dr 为标准品预稀释倍数； Es 为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数； Er 为标准品半效量的稀释倍数。
Hale Waihona Puke