1.2.4 不同温度培养检测平板的检测效果 用 25、30、35、37℃ 4 种不同的温度培养效价检测
培养基，以检验培养温度对琼脂扩散法测定效果的影响。
1.2.5 预培养方案 采用下面三种培养方案, 研究4℃预培养对琼脂扩散
法测定效果的影响。 方案 1：加入 nisin 标准液 4℃预培养 24h 后，置于
Issam Sebti等[12]在模拟nisin于琼脂糖凝胶中扩散时 发现，琼脂糖浓度增加可致使凝胶孔径狭小致密，从 而影响 nisin 在琼脂糖中的扩散。本研究中琼脂浓度与 琼脂扩散法的精确度呈负相关的原因可能与此相似。 2.2 培养温度对琼脂扩散法测定效果的影响
不同温度培养效价检测培养基 24h 后，除 25℃的指 示菌生长缓慢、抑菌圈边缘模糊外，3 0 、3 5 、3 7 ℃均
※生物工程
食品科学
2007, Vol. 28, No. 03 175
琼脂扩散法测定乳链菌肽效价的优化
张国只，陈林海 * ，杨天佑，陈洪卫，王利敏，段宇珩，秦广雍
(郑州大学离子束生物工程省重点实验室，河南 郑州
450052)
摘 要：对影响琼脂扩散法测定乳链菌肽效价的四个主要因素：琼脂浓度、Twee n20、培养温度、预培养进行 了研究。结果表明，0.75% 琼脂的效价检测培养基、0.5% Tween20 的添加以及 30℃培养条件，可提高乳链菌肽 效价测定的灵敏度和精确性；4 ℃预培养有利于乳链菌肽在琼脂中的扩散。 关键词：乳链菌肽；琼脂扩散；预培养
另外，在实验过程中还观察到，35℃和 37℃时 nisin 标准液蒸发很快，不利于 nisin 标准液在琼脂中充分扩 散，有碍于抑菌圈最佳效果的观察和测量。因此，选 定 30℃为 nisin 效价测定的最佳培养温度。 2.3 预培养对琼脂扩散法测定效果的影响
18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7
究的基础上，本文对影响 nisin 在琼脂平板上扩散的主 要因素，如琼脂浓度、培养温度、T w e e n 2 0 、4 ℃预 培养等进行系统研究，旨在对琼脂扩散法测定 nisin 效 价的条件进行优化。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 指示菌 藤黄微球菌Micrococcus luteus AS1.2156。
Piddock[13]在研究低温下细菌抗生素抗性的变化时发 现，低温条件能降低细菌对抗生素的抗性。本研究中 4℃预培养能显著提高琼脂扩散法的精确度的原因可能在 于低温下指示菌的抗性减弱，从而有利于 nisin 在检测 培养基中的扩散。Rogers 等[14]在研究 3℃低温预培养对 琼脂扩散法的影响时也得出了相近的结论。因此， 低温 预培养非常有利于提高琼脂扩散法的测定效果。 2.4 Tween20 对琼脂扩散法测定效果的影响
Optimization of Agar Diffusion Bioassay for Nisin
ZHANG Guo-zhi，CHEN Lin-hai*，YANG Tian-you，CHEN Hong-wei，WANG Li-min，
DUAN Yu-heng，QIN Guang-yong
(Ion Beam Bioengineering Provincial Key Lab, Zhengzhou University, Zhengz
1.5 1.7 1.9
nisin标准液对数值(U/ml)
1. 方案 1；2. 方案 2；3. 方案 3。
图 3 4℃预培养的影响 Fig.3 Effects of 4℃ pre-diffusion
三种预培养方案下的标准曲线见图 3 。从图 3 可见， 虽方案1的标准曲线的截距(即测定灵敏度)略低于方案2和 方案 3，但其标准曲线的斜率最大(8.2mm·ml/U)，明显 高于其它两个方案，这说明经 4℃预培养能显著促进 nisin 在测定培养基中的扩散，提高琼脂测定法的精确度。
不同琼脂浓度效价检测培养的标准曲线见图 1 。 从图 1 可以看出，琼脂浓度对标准曲线的截距影响不 大，这说明琼脂浓度对琼脂扩散法测定效价的灵敏度 影响不明显。但琼脂浓度对标准曲线的斜率影响较 大，且琼脂浓度与标准曲线的斜率呈负相关。琼脂浓 度为 0 . 7 5 % ，标准曲线的斜率最大，为 3 . 2 4 mm ·ml / U ， 这说明琼脂浓度 0 . 7 5 % 时，琼脂扩散法的精确度最高。
450052, China)
Abstract：The four major factors agar, Tween20, culture temperature and pre-diffusion, affecting the agar diffusion bioassay
for nisin were studied. The results showed that when agar concentration is 0.75%, the addition of Tween20 0.5%, and the culture
Key words：nisin；agar diffusion bioassay；pre-diffusion
中图分类号：Q331
文献标识码：A
文章编号：1002-6630(2007)03-0175-04
乳链菌肽(nisin)亦称为乳酸链球菌素，是由乳酸乳 球菌(lactococcus lactis)产生的一种34个氨基酸的多肽抗 菌物质，目前作为天然食品防腐剂已经在欧盟( E U ) 、美 国、中国、巴西等五十多个国家和地区广泛应用。测 定 nisin 效价的方法主要有琼脂扩散法[1]、浊度检测法 [2]、A T P 生物荧光法[3]、酶联免疫吸附法[4]、流式细胞 术法[ 5 ] 等方法。琼脂扩散法因具有简单、方便、经济 的特点，是目前较为常用的检测方法。根据扩散形式 的不同，琼脂扩散法可分为直线扩散法、点滴法、滤 纸片法、管碟法和打孔法，打孔法和杯碟法应用最为 广泛[1,6-10]。
1.1.5 指示菌菌悬液 250ml 三角瓶装牛肉膏蛋白胨液体培养基 30ml，接
种斜面保存的藤黄微球菌，180r/min，37℃摇瓶 24h， OD600 为 1.5 左右，浓度约为 1.76 × 107CFU/ml。 1.2 方法
1.2.1 nisin效价测定方法 效价检测培养基冷却至 45℃左右时，加入 2% 指示菌
※生物工程
1.0%，NaCl 0.5%，pH 7.0，1.1 × 105Pa，灭菌 20min。
1.1.4 nisin标准液 准确称取 10mg nisin 标准品(106U/g)，溶于 10ml
0.02mol/L 无菌 HCl 溶液中，配成 103U/ml 的 nisin 标准液， 室温放置 1h，4℃冰箱保存备用(不超过 7d)，需要时用 0.02mol/L 无菌 HCl 溶液稀释成 100、50、25、10、 5U/ml 五种效价的标准液。
抑菌圈直径(mm)
17
16
1
15
2
14
3
13
12
11
10
9
8
7 0.7 0.9 1.1 1.3 1.5 1.7 1.9
nisin标准液对数值(U/ml)
1. 30℃培养；2. 35℃培养；3. 37℃培养。
图 2 培养温度的影响 Fig.2 Effects of temperature
※生物工程
食品科学
抑菌圈直径(mm)
14
1
13
2
12
3 4
11
5
10
9
8 0.7 0.9 1.1 1.3 1.5 1.7 1.9
nisin标准液对数值(U/ml)
1. 0.75%；2. 1.00%；3. 1.25%；4. 1.50%；5. 1.75%。
图 1 琼脂浓度的影响 Fig.1 Effects of agar concentration
1.2.2 不同浓度琼脂检测平板的制备 制备琼脂浓度分别为 0.75%、1.0%、1.25%、1.5%
和 1.75% 效价检测培养基，效价测定方法参照 1.2.1 方法。
1.2.3 不同浓度 Tween20 检测平板的制备 在制备效价检测培养基时，分别按 0 . 0 % ( 对照) 、
0.50%、0.75%、1.0%、1.25% 和 1.50% 的浓度在效价 检测培养基内添加 Tw een2 0。
30℃培养箱培养 18h； 方案 2：加入 nisin 标准液后直接置于 30℃培养箱培
养24h； 方案 3：不加入 nisin 标准液 4℃预培养 24h 后，加
入 nisin 标准液，置于 30℃培养箱培养 18h。
1.2.6 标准曲线绘制及检测效果评价 用 ProtoCOL SR 测量仪测量抑菌圈直径后，以 nisin
temperature 30℃, the accuracy and sensitivity of agar bioassay for nisin can be improved. And the pre-diffusion at 4℃ can
enhance the diffusion of nisin in agar.
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.3%，蛋白胨
收稿日期：2006-04-30
*通讯作者
基金项目：国家重点基础发展计划(973 计划)项目(2004CB719604)
作者简介：张国只( 1 9 7 8 - ) ，男，硕士，主要从事微生物育种方面研究。
176 2007, Vol. 28, No. 03
食品科学
标准液对数值为横坐标，抑菌圈直径为纵坐标，绘制 标准曲线。
标准曲线斜率可反映nisin标准液浓度变化对应的抑
菌圈直径的变化，即测定的精确性，斜率越大扩散性越 好，反之越差；标准曲线与 y 轴截距可反映最低 nisin 效 价时，各处理抑菌圈直径的大小，即测定的灵敏度[ 8 ] 。