中国计划免疫 2001 年 6 月第 7 卷第 3 期
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百日咳疫苗免疫后的抗体检测方法
侯启明1, 梁雅文1, 张路民1, 秦进才1, 林燕华2, 李正英2
( 11 中国药品生物制品检定所, 北京 100050; 21 新疆生产建设兵团农二师医院, 新疆维吾尔自治区 库尔勒 841000)
表 1 疑似百日咳病人血清中抗 PT、FHA、AGGs 抗体检测结果
血清 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
月龄
18 19
4 5 3 41 5 3 成人 12 岁
抗- P T
( EU / ml) 1 5931 8 4511 2 281 1 2391 5 1211 8 141 2 1 9391 0 61 8 1131 2
结果
我们用纯化 PT 和 FHA 抗原 稀释成 1Lg PN/ ml 包被 96 孔酶标板, 以抗 PT 和抗 FHA 人免疫球 蛋白参考品为标准, 测定了疑似百日咳病人血清、未 接种过 DPT 婴幼儿的阴性血清和接种过 DPT 婴幼 儿的阳性血清中百日咳特异性抗体。 1 疑似百日咳病人血清抗体检测结果
收稿日期: 2000- 06- 20; 修回日期: 2000- 11- 30 作者简介: 侯启明( 1955- ) , 女, 河北省武强县人, 中国药品生物 制品检定所副研究员, 理学学士, 主要从事百日咳疫苗质量控制和质 量检定工作, 以及有关百日咳的研究工作。
该试剂盒能达到临床诊断快速、灵敏的效果。
抗- FHA ( GM T ? S)
( EU / ml)
抗- AG Gs ( GM T ? S) 效价
( 1: )
71 21 ? 31 264
81
71 70 ? 31 340
69
71 17 ? 31 254
106
11 61 ? 01 168
98
11 77 ? 01 153
105
11 52 ? 01 132
如表 1 所示, 在 9 份疑似百日咳病人血清中, 有 4 份血清抗 PT 和抗 FHA 抗体的酶标单位都超过了 百日咳 患者 恢复 期 20 ~ 30EU/ ml 的抗 体 阳性 指 标[ 7] , 2 份抗 PT 抗体超过阳性指标, 1 份抗 FHA 抗 体超过阳性指标, 共有 7 份血清与临床诊断相吻合, 其阳性率为 7718% 。在 9 份血清中采用常 规凝集 方法测定只有 3 份抗 AGGs 抗体达到了 1: 320 的抗 体阳性水平, 与临床诊断吻合率为 3313% 。说明测 定抗 PT 和抗 FHA 抗体的 EL ISA 诊断试剂盒在用 于百日咳诊断上比常规凝集方法敏感、准确。 2 未接种过 DPT 婴幼儿阴性血清的不同次检测结 果
材料与方法
1 抗 百日咳毒素 ( PT) 和 抗丝 状血 凝素 ( FHA) 人免 疫球 蛋 白参考品 丹麦世界卫生组织( WHO) 国际生 物制剂标准 实 验室国际参考品 JN IH- 10。含量为抗 PT 抗体 250EU/ ml; 抗 FHA 抗体 400EU / ml, 以测定的最高 OD 值等于 21 0 的稀 释 度为最佳稀释度。 2 抗原 冻 干的 纯 化 PT 抗原 ( 浓 度: 60Lg PN/ 支) 和 纯 化 FHA 抗原( 浓度: 60LgPN / 支) , 按 Sekura 和 Sato 法制备及 纯 化, 稀释成 1LgP N/ ml 包被 96 孔酶标板。 3 试剂 辣根 过氧化 物酶标 记结合物 羊抗人 Ig G( 工作 浓 度 1B280) , 底物为邻苯二氨基( O PD) , 抗 原包被液( pH91 6) , PBS- 吐温 20 洗涤液( pH714) , 2mol/ L H2SO4 终止液。 4 ELISA 诊断试剂盒血清学验证 41 1 血清样本 9 份 疑似百 日咳 病人 的血 清, 由北 京市 卫 生防疫站和中 国中医 研究 院西 苑医 院提 供。309 份 未接 种 过 DPT 婴幼儿的阴性血 清, 293 份接种过 DPT 婴幼 儿的 阳 性血清, 均由浙江省余杭市卫生防疫站提供。 41 2 微量凝集试验 按常规方法测定百日咳抗凝集原抗 体
摘要: 为了解决百日咳杆菌感染早期诊断不能及时准 确的难 题, 研 制了测 定百日 咳特异 性抗体的 酶联免 疫吸附 试 验( EL ISA) 诊断试剂盒。经采用 9 份疑似百日咳病人 的血清、309 份 未接种 过百白破 混合制 剂( DPT ) 的 婴幼儿 的 阴性 血清、293 份接种过 DPT 的婴幼儿的阳性血清验证, 证明 EL ISA 诊断试剂 盒测定百日 咳特异性 抗体的敏感 性 和准确性都高于常规的凝集试验, 能达到临床诊 断快速、灵敏的效果。 关键词: 酶联免疫吸附试验诊断试剂盒; 凝集试验; 抗百日 咳毒素抗体; 抗丝状血凝素抗体; 抗凝集原抗体 中图分类号: R5161 6 文献标识码: A 文章编号: 1006- 916X( 2001) 03- 0165- 03
Establishment of an ELISA Diagnostic Kit for Detecting Specific Antibodies of Pertussis HOU Q-i ming, LIANG Ya-wen, ZHANG Lu-min, et al. N ati onal Inst it ute f or t he Cont rol of Phar maceutical and Biological Pr oduct s, Beij ing 100050, Chi na.
的敏感性。
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表 2 不同次测定 阴性血清中抗 PT、抗 FHA 和
抗 AGGs 抗体的结果
血清 份数
102 87 63 84
抗- PT ( GMT ? S)
( EU / ml) 51 30 ? 31 550 61 63 ? 31 589 91 72 ? 11 761
抗- FH A
( EU / ml) 831 2 101 7 121 7
2511 5 131 0 911 8
4341 6 281 4 481 8
抗-AG Gs 效价( 1: )
80 40 160 160 40 320 320 80 1 280
接种史
不详 不详
1 1 0 1 0 不详 不详
是同一人上一份血清间隔 1 个月后的第 2 份血清。
87
351 12 ? 21307
84
641 45 ? 11 758
81
351 48 ? 21 016
90
1431 2 ? 01 490
表 3 显示, 使用 ELISA 试剂盒测定阳性血清可 以明显看出, 在接种过 DPT 婴幼儿体内已经产生具 有抵抗百日咳杆菌侵袭的抗 PT 、抗 FHA 保护性抗 体, 抗体水平超过了百日咳患者恢复期 20~ 30EU/ ml 的抗体阳性指标[ 7] 。而抗 A GGs 抗体的 GMT 仅 为 1: 143, 其中 \1: 320 者占 3617% 。说明在某些 情况下抗 AGGs 抗体不能反映了体内是否具有抗百 日咳杆菌感 染的 保护力 水平, 因此 应采 用敏 感的 EL ISA 试剂盒测定百日咳特异抗体, 用于判定接种 百日咳疫苗的效果。
讨论
在许多教科书上一般采用咳喋法或鼻咽拭子法 采集百日咳杆菌的标本, 再经过特殊培养基的培养, 根据细菌的形态和生化特征作为诊断百日咳杆菌感 染的临床判定依据[ 8] 。然而这种细菌 培养法在症 状不明显的患病早期无剧烈咳嗽时或年龄较小的婴 儿的情况下不易获得成功, 同时易染杂菌, 检出阳性 率不高。而且, 由于百日咳潜伏期和卡他期临床症 状只类似于上呼吸道的轻微感染, 临床医生很易忽 略是百日咳感染, 极难掌握采集ablished an EL ISA diagnost ic kit f or detect ing specif ic ant ibodies of pert ussis w hich solved the problem of early diagnosis of B. Pertussis infect ion. 9 sera of pertussis patients in doubt, 309 neg at ive and 293 positive sera of pertussis were det ect ed by this kit . T he result s show ed t hat t he EL ISA diagnost ic kit is sensit ive and accurat e w hen compared w it h the convent ional agglut ination t est. Key words: EL ISA diagnost ic kit; Agg lutination test; Ant-i P T ant ibody; Ant-i FHA ant ibody; Ant-i AGGs ant ibody .
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( 抗- AGGs) 滴度[ 5] 。 413 特异 性 抗 体 测 定 采 用 EL ISA 法 测 定 抗 P T 和 抗 FHA 特异性百日咳抗体。 5 结果 分析 使 用 IBM- PC SBL 软件[ 6] , 计算 抗 P T 和抗 FHA 抗体的酶标单位( EU / ml) 。
鲍特氏百日咳杆菌是引起 人类百日咳的 病原 菌。自 20 世纪 70 年代开始实施扩大免疫规划后, 百白破混合制剂( DPT ) 的免疫覆盖率明显提高, 有 效地阻止了百日咳的流行。但近几年一些国家百日 咳暴发的报道屡有出现, 主要发生在未免疫或免疫 不完全以及免疫后 10 年左右的青少年人群中[ 1~ 3] , 我国近期也 有在 局部 地区百 日咳 流行 的报 道[ 4] 。 目前, 百日咳杆菌感染的早期诊断是临床治疗时亟 需解决的一个问题, 一般使用的测定凝集抗体的方 法时间长、准确度不够, 百日咳疑似病人的诊断结果 与临床症状吻合性差。而免疫接种后的凝集抗体水 平与疫苗本身的凝集原含量有关, 又不能代表真正 的免疫效果。为此我们研制了测定百日咳菌特异性 抗体的酶联免疫吸附试验( EL ISA) 诊断试剂盒, 用 于测定百日咳菌所产生的特异性抗体。经初步测试