免疫荧光技术（检测抗核抗体（ANA）的实验方案）荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。
荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。
荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测，称为流式荧光免疫技术。
荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等。
本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(ANA)为例进行实习。
抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNA、可提取的核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。
抗核抗体实验原理以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Hep-2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上。
如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。
加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。
试剂与器材1．抗原片现多用商品试剂。
如需自行制备，方法如下：(1)肝印片制备：取4-8周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。
将肝脏剪成平面块，用生理盐水洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。
将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上留下薄层肝细胞。
冷风吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。
采用滴定平板技术进行间接免疫荧光实验为了使实验操作标准化，欧蒙开发了滴定平板技术? :滴加标本或标记抗体至加样板的反应区，然后将生物薄片载片盖在加样板表面的凹槽里，这时，载片上的所有生物薄片均与液滴接触，反应同时开始。
系统的几何结构决定了液滴的位置和高度。
因为液体被局限在一封闭的空间里，所以不再需要传统的“湿盒”。
并且可在一致的反应条件下同时温育任何数量的标本。
封片：在盖玻片上滴加甘油/PBS。
使用聚苯乙烯封片板。
从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。
将载片的生物薄片朝下置于准备好的盖玻片上，立即检查盖玻片是否放入载片的凹槽里，如有必要，需调整位置，正确放置。
然后再进行下一个载片的操作。
封片体积:10 µl/反应区(3 x 3 mm)10 µl/反应区(5 x 5 mm)20 µl/反应区(7 x 9 mm)结果判断：荧光显微镜下观察荧光。
具体操作荧光工作台的布置清洗载片的擦拭封片ANA的结果间接免疫荧光法的独特优势(一种基质–可筛查上百种不同的抗体 )用HEp-2细胞检测自身抗体ANA荧光模型核均质型核仁型核颗粒型胞浆型ANA确认实验（1）IFT:-HEp-2细胞/灵长类肝脏：特殊的荧光模型如着丝点、核膜型、核糖体P蛋白、肌动蛋白ELISA:-ANA分项(含ENA 谱):包被高度纯化抗原斑点法/ 印迹法-ENA 谱:采用各种高度纯化的抗原ELISA：抗ENA 谱印迹法：抗ENA 谱印迹法：抗ENA谱免疫印迹法ANA确认实验（2）Westernblot:HEp-2 细胞提取物- 定性- 适宜特别需要（如区分靶抗原Ro 52 或Ro 60）- 检测目前无法纯化的靶抗原的抗体（如PM-Scl、Ku）结论初筛实验：免疫荧光技术(HEp-2细胞/灵长类肝脏）ELISA （纯化的多种核抗原）确认实验：核仁型（nucleous pattern，N）核膜型（membranous pattern，M）着丝点型（centromert pattern，ACA）胞浆型（cytoplasmic pattern，ACYA）HEp-2细胞/灵长类肝脏：核均质型ssDNA / dsDNA靶抗原：单链、非天然DNA（嘌呤和嘧啶硷基对）双链、天然DNA （脱氧核糖核酸结构）相关性：ssDNA类风湿80.8%SLE 40.0%干燥综合征44.0%皮肌炎12.3%类风湿性关节炎 51.7%献血员 6.8%SLE 30% - 90%抗dsDNA：绿蝇短膜虫组蛋白靶抗原：组蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4（主要抗原H1和H2B）功能：形成核小体相关性：药物诱导性LE:100%（唯一的标志抗体）SLE：40% - 80%其它风湿性疾病：少见HEp-2 细胞/灵长类肝脏：抗RNP/SmU1-nRNP靶抗原：与U1-nRNA 连接的3个蛋白分子（70K、A和C蛋白）功能：切割pre-mRNA相关性：MCTD: 95% - 100%SLE: 15% - 40%抗Sm抗体靶抗原：与U1-、U2-、U4-、U5- 或U6-nRNA 连接的6 种不同蛋白分子（core proteins B, B´, D, E, F, G）功能：切割pre-mRNA相关性：SLE: 5% - 30%HEp-2细胞/灵长类肝脏: 抗核糖体P蛋白抗核糖体P蛋白抗体抗原：核糖体的亚单位( 60S), 3个蛋白分子组成: P0、P1、P2 （38、19、17 kDa）。
在碳末端具有相似的免疫反应表位。
功能：蛋白合成易位过程中的辅蛋白相关性：SLE：5% - 15%原发性干燥综合征的抗体谱靶抗原阳性率（%）SS-A 40-95SS-B 40-95ssDNA 40-95HEp-2 细胞/ 灵长类肝脏：抗SS-A/SS-B抗SS-A抗体靶抗原：与Y1, Y3, Y4 或Y5 型RNA 连接的2个蛋白（52 kDa和60 kDa）功能：调节mRNA 的转译活性相关性：干燥综合征：40% - 95%SLE: 20% - 60%抗SS-B抗体靶抗原：与小分子RNA （U6-RNA, pre-tRNA）结合的磷脂蛋白（48 kDa）功能：RNA多聚酶III的辅蛋白相关性：干燥综合征：40% - 95%SLE: 10% - 20%进行性系统性硬化征的抗体谱靶抗原阳性率（%）着丝点 80-95Scl-70 25-75ssDNA 30-60原纤维蛋白5-10RNA 聚合酶 4PM-Scl（重叠综合征）3NOR-90 （核仁形成区）少见Ku （多肌炎型重叠综合征） 1-7HEp-2 细胞/灵长类肝脏：抗着丝点抗体抗着丝点抗体靶抗原：连接动粒（着丝点）上的4个蛋白分子：A- 、B- 、C-、D-蛋白，分子量（17 、80、140、50 kDa)主要的靶抗原：着丝点B蛋白（与IIFT相关性：100%）功能：与纺锤体纤维连接相关性：硬皮病：18%局限性硬化征(CREST 综合征):80%-95% HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗Scl-70抗Scl-70抗体靶抗原：DNA拓扑异构酶I （100 kDa）功能：DNA复制和翻译过程的辅蛋白相关性：硬皮病：25% - 75%HEp-2/灵长类肝脏：抗PM-Scl抗PM-Scl抗体靶抗原：多个蛋白分子的复合物主要的靶抗原100 kDa（与DNA拓扑异构酶I不同）功能：未知相关性：硬皮病：2% - 5%肌炎：8%重叠综合征：24%HEp-2 细胞/ 灵长类肝脏：抗RNA多聚酶RNA多聚酶I、II和III靶抗原：多个蛋白亚单位组成的核仁酶复合物功能：多聚酶I: 转录rRNA基因多聚酶II: 转录mRNA 基因多聚酶III: 转录tRNA基因相关性：硬皮病：4%HEp-2 细胞/ 灵长类肝脏：抗原纤维蛋白抗原纤维蛋白（U3-nRNP）抗体靶抗原：与基础蛋白（34 kDa）连接的U3-nRNA和其它5个蛋白功能：分离pre-rRNA相关性：皮肌炎：5% - 10%HEp-2 细胞/ 灵长类肝脏：抗NORHEp-2 细胞/ 灵长类肝脏：抗Ku多肌炎和皮肌炎的抗体谱靶抗原阳性率（%）ssDNA 40-50Jo-1 25-35PM-Scl（重叠综合征）8Mi-2 5Ku （带硬皮病的重叠综合征）1-7PL-7、PL-12、OJ、EJ、KJ 2-3HEp-2 细胞/ 灵长类肝脏:抗Jo-1Jo-1靶抗原：组氨酰tRNA合成酶（50 kDa）细胞浆磷脂蛋白功能：将氨基酸与相应的tRNA连接相关性：多肌炎、皮肌炎25% - 35%伴有肺间质纤维化的多肌炎70% 原发性胆汁性肝硬化的自身抗体谱靶抗原阳性率（%）AMA M2 85-95AMA M4 40-60AMA M9 35Sp-100 （nuclear dots）30Actin 10-20HEp-2 细胞/ 灵长类肝脏：抗线粒体抗AMA M2 抗体靶抗原：含3个不同的酰基转移酶的多酶复合物: - 丙酮酸脱氢酶（74 kDa）- 2-酮酸脱氢酶（50 kDa）- 2-酮戊酸脱氢酶（50 kDa）蛋白X (52 kDa), 与丙酮酸脱氢酶复合物相关相关性：PBC: 85% - 95%HEp-2 细胞/ 灵长类肝脏:核点型HEp-2 细胞/ 大鼠肾:核点型/ AMAHEp-2 细胞/ 灵长类肝脏：着丝点+ 核点型HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗肌动蛋白HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗核膜型联合a生物薄片（HEp-2/猴肝冰冻组织切片）检测到的一些少见的特殊的荧光模型与细胞周期相关的荧光模型HEp-2 细胞/灵长类肝脏：抗周期蛋白IHEp-2细胞/灵长类肝脏：抗周期蛋白IIHEp-2细胞/灵长类肝脏：中心粒HEp-2细胞/灵长类肝脏：纺锤体纤维HEp-2细胞/灵长类肝脏：中间体细胞浆中的抗体HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗溶酶体抗体HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗高尔基体HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗波形蛋白HEp-2 细胞/灵长类肝脏：抗原肌球蛋白灵长类肝脏：抗肌内膜抗体灵长类肝脏：抗胆管抗体灵长类肝脏：ANCAc-ANCA阳性p-ANCA阳性。