固定化动物细胞大规模培养技术研究进展石　凯1　熊晓辉1　许建生2(1南京工业大学制药与生命科学学院,南京,210009;2苏州农业职业技术学院,苏州,215008)摘　要　介绍了固定化动物细胞培养过程中主要的技术及其进展,包括吸附、包埋、中空纤维、微囊化等。

并在此基础上探讨了固定化动物细胞培养中尚存在的问题以及未来的发展方向。

关键词　固定化,动物细胞培养,吸附,微载体,包埋,中空纤维,微囊化中图分类号　Q 813.1+1 文献标识码　A 文章编号　1000-6613(2002)08-0556-04 固定化技术作为实现动物细胞大规模培养的重要途径,相对悬浮培养而言具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强、产物易于收集和分离纯化、对贴壁型和非贴壁型细胞都适用的优点,因此在动物细胞的大规模培养上得到越来越广泛的应用,相继出现了微载体、中空纤维及微囊化等多种固定化培养技术。

本文作者将结合动物细胞的培养特性,介绍目前动物细胞大规模培养中的固定化技术。

1　动物细胞的特点及生长特性动物细胞虽可像微生物细胞一样,在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养,但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比,有显著差别[1]:①动物细胞比微生物细胞大得多,无细胞壁,机械强度低,对剪切力敏感,适应环境能力差;②倍增时间长,生长缓慢,易受微生物污染,培养时须用抗生素;③培养过程需氧量少(氧传质系数k L a 大于10h -1即可满足每毫升107个细胞的生长);④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在;⑤原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡;⑥代谢产物具有生物活性,生产成本高,但附加值也高。

动物细胞根据其在体外培养时对生长基质的依赖性差异,分为锚地依赖性和非锚地依赖性。

大多数分泌药用蛋白的动物细胞属于锚地依赖性细胞,即要有足够地支持细胞贴壁的表面,又要保持均匀悬浮状态。

固定化技术就是解决这两个问题的有效途径。

2　固定化培养方法在传统的固定化酶技术中,常采用戊二醛、聚丙烯酰胺、聚氨酯等作为固定化细胞载体。

但在动物细胞培养中,培养细胞的目的不仅仅要求催化活力,更重要的是利用细胞来合成和分泌蛋白,因此如何保持细胞的活性显得尤为重要。

由于动物细胞的极度敏感性,上述这些固定化方法会对动物细胞产生毒性,另外多糖(如卡拉胶等)由于具有很高的离子强度也会对细胞产生毒害。

故在动物细胞培养中要考虑使用较温和的固定化方法,如吸附、包埋、中空纤维或胶囊化。

2.1　吸附2.1.1　多孔陶瓷KC.Biologicals (USA )公司开发了一种完全自动化的细胞培养系统[2]。

该系统的核心是陶质矩形蜂窝状生物反应器。

反应器构型是一圆筒内装置有许多陶质矩形通道的蜂窝状圆柱体。

通道长30cm ,截面积是长方形,约为1mm 2,壁厚0.12mm ,可提供4.25m 2的生长表面积。

这种结构的生物反应器,既可用于培养悬浮生长的细胞,又可用于培养贴壁依赖性细胞。

该系统可以连续化生产蛋白质。

由于产物直接分泌到培养基中,给分离纯化带来方便。

而且细胞不用从培养基中分离,所以不必考虑梯度问题;当培养基高速循环时,可以保持相对恒定的营养物和氧浓度。

增加套数即可实现放大。

2.1.2　微载体微载体细胞培养法是一种用于培养锚地依赖性细胞的大规模培养技术,由Van Wezel [3]于1967年首创。

这种培养技术是在生物反应器内加入培养液和一种对细胞无毒害作用的材料支撑的颗粒(微载体),使细胞在微载体表面附着和生长,并通过不断搅拌使微载体保持悬浮状态。

培养液中大量的收稿日期　2001-12-07;修改稿日期　2002-03-05。

第一作者简介　石凯(1977—),男,硕士研究生。

电话025-*******-3716。

・655・ 2002年第21卷第8期　化 工 进 展CHEMICAL INDUSTR Y AND EN GIN EERIN G PRO GRESS微载体为细胞提供了极大的附着表面,1g微载体其比表面积可达6000cm2,从而可实现细胞的高密度培养[4]。

微载体的直径在60～250μm,由天然葡聚糖、凝胶或各种合成的聚合物组成,如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等[5～7]。

由这些材料及其改良型制成的微载体主要参考了细胞的粘附特性,在其表面带有大量电荷及其他生长基质物质,因而有利于细胞的粘附、铺展和增殖。

Van Wezel当时选用的是阴离子交换树脂Sephadex A50培养动物细胞,其后Van Hemert、Spier及Whiteside也相继作了培养仓鼠肾细胞(BH K21)等细胞及生产口蹄疫苗的报道[8]。

采用微载体培养具有以下优点:①比表面积大,单位体积培养液的细胞产率高;②采用均匀悬浮培养,无营养物或产物梯度;③可用简单显微镜观察微载体表面的生长情况;④细胞收获过程相对简单,劳动强度小;⑤培养基利用率高,占地面积小;⑥放大容易,国外已有公司以1000L规模培养人的二倍体细胞来生产β-干扰素。

但其缺点是搅拌桨及微珠间的碰撞易损伤细胞;接种密度高;微载体吸附力弱,不适合培养悬浮型细胞。

2.1.3　大孔微载体人们为了解决微载体培养系统中细胞易受机械损伤的缺陷以及能最大限度地扩大比表面积,开发了具有完全连通沟回的大孔微载体。

这一方法首先是在1985年由Verax公司开创的(Verax系列大孔加重胶原珠),其后出现了多种大孔微载体。

张孝兵等[9]将广泛使用的Verax流化床系统与常规传统大规模培养系统结果做了比较,发现Verax系统的细胞密度和体积产率比相应的常规培养高。

由于大孔微载体将细胞固定在孔内生长,因而与其他方法相比具有一系列优点:①比表面积大,是实心微载体的几倍甚至几十倍;②细胞在孔内生长,受到保护,剪切损伤小;③与包埋法相比,传质尤其是传氧效果好[10];④两种类型细胞都适用;⑤细胞三维生长,细胞密度是实心微载体的10倍以上,有的可达108个/mL[11];⑥适用于长期维持培养,例如Verax流化床培养系统能维持培养100多天,细胞生长情况依然良好;⑦微载体浓度高,实心载体在培养液中浓度增大到一定时,细胞密度反而下降;而大孔微载体在浓度较高时,表面碰撞增加,能促使细胞在孔内生长;⑧最适合于蛋白质生产和产物分泌。

因此有人预言,大孔微载体技术将成为动物细胞大规模培养的一种常用方式。

2.2　包埋将动物细胞包埋在各种多聚物多孔载体中而制成固定化动物细胞的方法称为包埋法。

此法步骤简便,条件温和,负荷量大,细胞泄露少。

因细胞嵌入在高聚物网格中而受到保护,细胞能抗机械剪切。

但该法也有一定缺点,如扩散限制,并非所有细胞都处于最佳营养物浓度。

包埋法一般适用于非锚地依赖型细胞的固定化。

多孔凝胶是最常用的载体,用于动物细胞固定化的凝胶主要有海藻酸钙、琼脂糖、血纤维蛋白等。

2.2.1　海藻酸钙凝胶海藻酸钙凝胶包埋法是将动物细胞与一定量的海藻酸钠溶液混合均匀,然后滴到一定浓度的氯化钙溶液中形成直径约1mm内含动物细胞的海藻酸钙胶珠,分离洗涤后即可用于培养。

此法操作时条件温和,对活细胞损伤小。

但固定后机械强度不高。

为了大量制备海藻酸钙凝胶包埋的固定化细胞,国外已有专门的振动喷嘴设备可供使用[12]。

2.2.2　琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶可用二相法制得。

将含有细胞的琼脂糖溶液分散到一个水不溶相中(如石蜡油),形成直径0.2mm凝胶珠珠,移去石蜡油后,细胞即可进行培养。

同海藻钙一样,琼脂糖更适于培养悬浮细胞。

尽管凝胶珠形成过程很复杂,目前放大体积不超过20L。

但琼脂糖凝胶无毒性,具有较大的空隙,可以允许大分子物质自由扩散,因此该法特别适用于蛋白产物的连续生产。

Mosbach等曾用琼脂糖包埋杂交瘤细胞L S21和淋巴细胞MLA144生产单克隆抗体和白细胞介素[13]。

2.2.3　血纤维蛋白将动物细胞与血纤维蛋白原混合,然后加入凝血酶。

凝血酶将血纤维蛋白原转化为不溶性的血纤维蛋白,将动物细胞固定在其中。

血纤维蛋白可以促进细胞贴壁,因此两种类型的细胞都适于培养。

而且基质高度多孔,允许大分子物质的自由扩散。

但机械强度差,对剪切力很敏感。

2.3　中空纤维中空纤维细胞培养技术是模拟细胞在体内生长的三维状态,利用一种人工的“毛细管”即中空纤维给培养的细胞提供物质代谢条件而建立的一种体外培养系统。

自从1972年Knazek等[14]首次报道该技术后,陆续已有许多关于用中空纤维系统培养・755・　第8期 石凯等:固定化动物细胞大规模培养技术研究进展 动物细胞的研究工作。

典型的封闭式中空纤维反应器循环系统[15]如图1所示。

系统的核心装置是中空纤维反应器,里面封装了一束中空纤维将整个反应器内腔分为毛细管外空间(extracapillary space ,ECS )和内腔空间(lumen space ,LS )。

培养细胞接种到ECS 中,培养液和氧气灌注到纤维管中,依靠蠕动泵的推动在系统中循环,并通过扩散作用从LS 提供给细胞[16]。

图1　封闭式中空纤维反应器循环系统示意图这种柱状反应器的不足之处是营养供应和细胞代谢产物存在浓度梯度,因而细胞分布不均,培养贴壁细胞时不能扩展成单层。

为此,Feder 等[17]开发出将纤维管束横放的平板式浅床中空纤维反应器(flat -bed hollow fiber bioreactor )。

将若干层浅床组合在一个反应器中,床层深度相当于3～6层纤维管,为使培养液分布均匀,在床层两端安装了2μm 微孔的分布器。

中空纤维培养技术的优点是无剪切、高传质、营养成分的选择性渗入,使培养细胞和产物密度都可达到比较高的水平。

缺点是膜的污染和堵塞,观察困难,细胞生长或过量气体产生会破坏纤维[18]。

中空纤维培养技术的发展趋势是让细胞在管束外空间生长,以达到更高的细胞培养密度。

目前中空纤维反应器已进入工业化生产,主要用于培养杂交瘤细胞来生产单克隆抗体,如Bioresponse 和Invitron 公司利用这种反应器生产单克隆抗体[19]。

2.4　微囊化微囊化培养技术是20世纪70年代由Lin 和Sun 创建的一种大规模培养技术[20]。

其要点是:在无菌条件下将拟培养的细胞、生物活性物质及生长介质共同包裹在薄的半透膜中形成微囊,再将微囊放入培养系统内进行培养。

生长介质为1.4%海藻酸钠溶液,半透膜由多聚赖氨酸形成。

培养系统可采用搅拌式或气升式反应器系统。

微囊工艺已生产出以克计的单克隆抗体[21]。

实验证明,采用批式和连续灌注式培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体,在7～27d 微囊内抗体浓度可达1250～5300mg/L [22]。

利用微囊包裹具有特定功能的组织细胞,形成免疫隔离的人工细胞,以此植入疾病动物或病人体内。

由于微囊里外来的组织细胞分泌分子量小于11×104ku (u =(116605402±010000010)×10-27kg )的激素和介质等物质,可补充疾病体内缺乏的生理活性物质,从而达到治疗疾病的目的,并且不引起免疫排斥现象。