原代培养期 1.特征： 完成过渡和适应过程，恢复分裂增殖和生长发
育能力。 细胞呈现异质性 细胞的结构和功能最接近在体时情况
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2. 主要生长生物学行为：
黏附和贴壁：是细胞培养能否成功的第一步 ① 细胞与固相表面亲和性的大小，主要与
细胞表面及固相表面所带电荷的性质和量有关 。
② 贴壁与黏附只是程度上的不同 ③ 不同细胞的黏附能力不同 ④ 影响细胞黏附和贴壁的因素： 培养液的温度、培养液中的离子成分及其 浓度、培养器皿表面包被的某些生物活性物质 22
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※ 低温的影响： （1）生理温度范围内，温度越低酶活性越低，当降到细胞 所能忍受的最低限度时，细胞的生命活动即受到抑制。 （2）使核分裂的时间延长 （3）使细胞的代谢活动降低 （4）能造成一定的细胞死亡
3.气相环境
※ O2（1995－9975pa）参与细胞的能量代谢过程，CO2（95
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（4）IMDM （Iscove’s modified Dulbecco’s medium）属高糖型；适合于细 胞密度低，细胞生长较困难的情况。
（5）RPMI-1640（1630，1634） （6）HamF7、10、12 ：特点：添加了 微量元素和无机离子 (7) McCoy’s5A：适合于较难培养的原 代培养细胞
主要形态学特征：扁平，形态较为规整，呈 多角形，中央有圆形核，生长时常彼此紧 密连接成单层细胞片，呈“铺路石状”。
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生长特点： 易相连成片 相靠—紧密相 连—成薄层—铺 石状 生长时呈膜状移 动 很少脱离细胞群 而单个活动
上皮型细胞
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（3）游走型细胞：
来源：具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞（
D.鼠尾胶原
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※合成培养基：基本培养基、无血清培养基
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A. 基本培养基（通用培养基） 基本培养基的分类： （1）199 培养基 （2）低限量基础Eagle 培养基（
minimum essential media，MEM） （3）DMEM （Dulbecco’s modified
Eagle medium）：增加了各成分的用量； 分高糖型和低糖型。
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※ pH调整液 A. 碳酸氢钠溶液：是培养基中必须添加的成分；使用浓度： 7.4%、5.6%、3.7% B. Hepes液：是一种弱酸，能防止培养基pH值迅速变动，可 维持pH值在7.0左右。呈橘红色，生长过程变化不大。
※ 谷氨酰氨补充溶液 （1）在细胞代谢中起重要作用，易降解，在使用前添加
。
判断细胞生长是否旺盛的指标：①有丝分裂指 数；②细胞群体倍增时间；③MTT法（酶活性）④ 3H-TdR掺入法（DNA合成快慢）⑤接触抑制。
停滞期(stagnate phase) 也称平台期(plateau phase)
衰退期
向前发展，只有退化死亡。
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第二节 动物细胞培养所需的基本条件
一、培养用液 二、影响动物细胞体外生长的因素
——需载体。
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培养方法
原代细胞培养 ●依细胞来源，可分 传代细胞培养
液体培养 ●依培养液种类不同，可分 固定培养
静止培养、旋转培养、搅拌培养 ●依反应器类型和操 中空纤维培养
作方式不同，可分 固定床或流化床培养 悬浮培养
●依在反应器生长 贴壁培养 形式不同，可分 贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）
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培养过程
起化学作用的物体表面时，才能生长、生存或 维持其功能的细胞。 2．分类 ：(1)成纤维型细胞；(2)上皮型细胞；(3)游 走型细胞；(4)多形型细胞
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（1）成纤维型细胞：
来源：中胚层的细胞，如成纤维细胞、血管 内皮、心肌、平滑肌、成骨细胞等。
主要形态学特征：细胞呈梭形或不规则形， 中央有圆形核，胞质向外伸出2-3个长短 不同的突起，细胞群常连接成网，生长时 呈放射状、旋涡状走向。多数细胞之间排 列疏松，有较大细胞间隙。
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生长特点： 排列成放射状， 漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞—细胞接触 易断开而单独行 动 游离的单独的成 纤维样细胞，常 有几个伸长的细 胞突起
成纤维型细胞
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（2）上皮型细胞：
来源：外胚层和内胚层组织的细胞，如皮肤 的表皮细胞、消化道与呼吸道的上皮细胞 、肺泡上皮细胞、消化腺上皮细胞、血管 内皮细胞等。
合于一种细胞的生长。
无血清培养基的基本配方：
（1）基础培养液：1F12 ：1DMEM （2）补充成分：激素（胰岛素）和生长因子
、结合蛋白（转铁蛋白） 、贴壁因子和铺展因子
、微量元素（硒）和低分子量营养因子、酶抑制
剂
使用方法：P130
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无血清培养基： 优点：化学组分明确，批次间重复性好，易检测，适合特定
如颗粒性细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细 胞等）。在植块培养时，这类细胞最先从植块 迁移出来。
形态学特征：细胞相互分开；常具有胞质突起或
伪足，呈活跃的游走和变形运动，速度快而方 向不规则。当细胞密度增大时，游走受限，类 似上皮型或成纤维型的细胞。
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（4）多形型细胞：
是一些形态上不规则的细胞，但不规则 形态不是由胞质突起所致，而是一般分胞 体和胞突两部分，胞突为细长形，胞体呈 多角形，但没有成纤维细胞那样不规则。 体外培养中最常见的是神经元和神经胶质 细胞。
成纤维细胞样 上皮样细胞
细胞密度 3T3 低密度
成纤维细胞样
高密度
上皮样细胞
生长状态改变 悬浮或贴附
转化与否
悬浮
圆形
未转化
贴附
成纤维或上皮样
转化后
成纤维样
可成上皮样
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悬浮型细胞
1．定义：是不必附着于固相支持物表面，而在悬浮 状态下即可生长的细胞。
2．来源 自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞，癌肿细胞也 可能
素。 ② 激素和生长因子 ③ 渗透压 ④ pH ⑤ 无毒无污染
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※天然培养基：是指来自动物体液或利用组织分离提 取的一类培养基。 A. 血清（最常用，重要！） 种类：新生牛（24H）、胎牛、小牛（10～30D） 血清的成分：多种蛋白质、无机离子、脂肪、维生素
、激素、生长因子、转移蛋白等
血清的作用：
（2）一般放置4℃两周后降解。 （3） 使用浓度：0.002mol/L （4）配置成100倍浓缩液，过滤除菌分装，-20℃贮存
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※抗生素液：培养液加适量抗生素，不易污 染，常用为双抗溶液。 （1）青霉素使用终浓度：100000 u/L （2）链霉素使用终浓度：0.1 g/L （3）配置方法：100倍浓缩液，可用培养 液或PBS配置。
② 动物细胞对培养环境适应性差
—— 生长慢，时间长，生长用动物细胞需驯化；
③ 动物细胞培养对环境条件要求严格
——pH，混合气体（O2、CO2、N2）；
④ 动物细胞培养过程易产生污染
—— 要求苛刻；
⑤ 各种细胞素长期培养易变异
——需监测其形态、生长、表达过程；
⑥ 绝大多数的哺乳类动物细胞具贴壁依赖性生长特征
3.特点 在悬浮中生长良好 细胞圆形，单个或小细胞团。
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4．优点：
（1）培养密度可以较大，培养效率高； （2）传代方便（不需消化）； （3）易于收获； （4）可获得稳定状态。
5．缺点：
（1）观察不方便； （2）很多细胞不能悬浮生长（尤以正常细胞）。
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二、体外培养细胞的生长与增殖过程
从总的过程讲，整个生命活动可分为：原（初）代培养 期、传（继）代培养期、衰退期。
（1）提供基本的营养物质 （2）提供贴壁和扩展因子 （3）提供激素及各种生长因子 （4）提供结合蛋白 （5）对培养细胞提供某些保护作用
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使用血清的缺点: （1）可能改变细胞在体内的正常状态 （2）有些物质对细胞产生毒性作用 （3）每批次血清之间都有差别 （4）取材过程有可能带入支原体、病毒
血清的质量标准: （1）鉴定内容： ① 理化性质：蛋白含量（总蛋白、球蛋
白、血红蛋白含量） ② 微生物检测 ③ 促生长效果
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（2）血清的使用和储存 ① 使用前的处理：灭活（56℃，30min） ② 储存条件：-20℃ ③ 使用浓度
B. 胚胎提取液（早期，鸡胚和牛胚） C. 水解乳白蛋白（氨基酸含量高，由乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水
解后得到的淡黄色粉末，一般可配制成0.5%溶液。 ）
过程； 缺点：比较贵，针对性强。
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3.杂用液（其它常用液）
※ 消化液 A. 胰蛋白酶（trypsin）液 （1）活性表示方法（酪蛋白） 1：125或1：250 （2）常用浓度：0.25% 和0.125%
（3）PH值：7.4左右
（4）注意：用无钙镁溶液配置。血清和钙镁离子均可 抑制其活性 B. Na2EDTA溶液
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二、影响动物细胞体外生长的因素
1.营养成分和生长基质
※ 营养条件：是基本条件，始终缺乏某些尚不清楚的与细 胞生长发育和功能活动有关的微量成分。
※ 生长基质
2.温度
※ 高温的影响： （1）破坏细胞内的酶 （2）破坏细胞膜上的脂类 （3）影响细胞的分裂（破坏纺锤体，使细胞不能分裂； 引起细胞分裂异常，出现多极分裂）
（1）使用浓度：0.2%（常用D-Hanks液配制） （2）高压灭菌后使用 （3）可配合胰酶使用
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C. 胶原蛋白酶（collagenase）液 （1）作用对象：胶原 （2）用于上皮类细胞的原代培养 （3）使用浓度：0.1～0.3mg或
200000U/L （4）PH值：6.5 （5）不受血清和钙镁离子抑制
铺展：是进行生命活动的基本的生长特点或生长 行为
描述铺展状况的参数： ① 培养细胞的面积大小（测微尺） ② 培养细胞的高度（细胞在垂直方向上的厚度
） ③ 聚焦时微调旋扭刻度值的变化程度 ④ 细胞的贴壁延展过程