酶 活 测 定
1（级分I和级分 测定管） （级分 和级分 测定管） 和级分II测定管 10%蔗糖溶液 蔗糖溶液ml 蔗糖溶液 pH5.0醋酸缓冲液 醋酸缓冲液ml 醋酸缓冲液 0.60 1.30 25℃水浴中保温3min ℃水浴中保温 稀释X倍以后的酶液 稀释 倍以后的酶液ml 级分I和级分 和级分II） （级分I和级分II） 0.10 25℃水浴5min ℃水浴 二硝基水杨酸试剂0.5ml 二硝基水杨酸试剂 0.1mol/LNaOH溶液 溶液2.5ml 溶液 沸水浴煮5min 沸水浴煮 二硝基水杨酸试剂0.5ml 二硝基水杨酸试剂 2（对照I和对照 ） （对照 和对照 和对照II） 0.60 1.30 0.1mol/LNaOH溶液 溶液2.5ml 溶液 0.10
取出后经自来水冷却3min，以标准曲线的“0”管调零点，于540nm ， 标准曲线的“ 管调零点 管调零点， 取出后经自来水冷却 处测光密度值。以测定管的光密度值减去对照管光密度值， 处测光密度值。以测定管的光密度值减去对照管光密度值，求得的差 值从标准曲线上查得相应的葡萄糖含量， 乘以10， 值从标准曲线上查得相应的葡萄糖含量，并乘以 ，即为每 1ml酶溶 酶溶 液的活力。（对照管中酶液最后加入） 。（对照管中酶液最后加入 液的活力。（对照管中酶液最后加入）
实 验 结 果
1、葡萄糖浓度的标准曲线 2、蔗糖酶制备过程中的级分I和级分II中的蔗糖酶的活力。（每 1ml酶溶液的活力）
0.1ml稀释后的酶A540—根据标准曲线计算反应中葡萄糖的产量—稀释的倍数——1ml酶活力
3、蔗糖酶制备过程中1ml 级分I和级分II中蛋白质的含量。 4、比活力的计算：
级分I和级分II中的蔗糖酶的活力 1ml级分I和级分II中蛋白质的含量
蔗糖酶活性测定原理
• 蔗糖酶特异性催化非还原糖中的α-呋喃果糖苷键水 解,具有相对专一性,能催化蔗糖水解生成D-果糖和 D-葡萄糖,也能水解棉子糖生成密二糖和果糖 • 3,5-二硝基水杨酸与还原糖在强碱性溶液中沸水浴 生成棕红色氨基化合物.在540nm处有最大吸收,在 一定范围内颜色深浅与还原糖浓度成正比 • 酶活性单位为,在一定条件下反应5min,每产生1mg 葡萄糖所需要的酶量。实际应用是1 ml酶液所产生 葡萄糖的量定为1ml酶液的活力。 • 酶的比活力，每 mg酶蛋白质所具有的酶活力。
加毕混匀，盖上试管帽，于沸水浴（ 加毕混匀，盖上试管帽，于沸水浴（100℃）中准确煮 ℃ 中准确煮5min，取 ， 出用自来水冷却3min，以零号管调零点，于540nm处测定光密度。 处测定光密度。 出用自来水冷却 ，以零号管调零点， 处测定光密度 以葡萄糖含量为横坐标，以光密度为纵坐标画葡萄糖标准曲线图。 以葡萄糖含量为横坐标，以光密度为纵坐标画葡萄糖标准曲线图。
实验 七 蔗糖酶和制备和比活力的测定
1. 酵母蔗糖酶的制备 2. 各级分蔗糖酶溶液活性的测定 包括葡萄糖标准曲线的制备） （包括葡萄糖标准曲线的制备） 3. 各级分蔗糖酶溶液蛋白质含量的测定 4. 各级分蔗糖酶溶液比活力的计算
蔗糖酶制备的原理
• 酵母中的蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内 侧，在细胞膜外细胞壁中的,称之为外蔗糖酶，其活力占蔗 糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞 膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种 酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨 基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和 Met，它们的分子量也不同，外酶约为27kDa(或22 kDa， 与酵母的来源有关)，内酶约为13.5kDa。 • 两种酶底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实 验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取， 本实验采用研磨水抽提，提取纯化的主要是外酶。
5、乙醇沉淀后的固体蔗糖酶（分装两支1.5ml离心管中，4℃保 存，备用）
思 考 • 比较级分I和级分II的比活力，试分析级分II比活力高 的原因。
葡萄糖标准曲线的制备
管号 试剂 标准葡萄糖溶液 （1mg/ml） ml ） pH5.0 0.1M醋酸缓冲液 醋酸缓冲液 ml 二硝基水杨酸溶液ml 二硝基水杨酸溶液 0.1mol/LNaOH溶液 溶液ml 溶液 0 2.0 0.5 2.5 0.6 1.4 0.5 2.5 0.8 1.2 0.5 2.5 1.0 1.0 0.5 2.5 1.2 0.8 0.5 2.5 1.4 0.6 0.5 2.5 0 1 2 3 4 5
蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝方法）
• 对照：0.5ml水+5ml考马斯亮蓝溶液，混匀后室温放置5分 钟以上。 • 样品：将级分I和级分II分别稀释100或者50倍，取稀释后 的酶液0.4ml，加入0.1ml水，混匀后加入5ml考马斯亮蓝 0.4ml 0.1ml 5ml 溶液，混匀后室温放置5分钟以上。 • 对照作为参比，测定级分I和级分II的A595。 • 参照以前实验课中的考马斯亮蓝方法中的蛋白质浓度标准 曲线，计算出级分I和级分II中蛋白质含量。 公式： y=0.0035x X代表溶液的浓度（µg/ml），Y代表595nm下的吸收值。
蔗糖酶制备的方法
• 实验方法参看实验指导教材（p76）。 • 注意级分II同书上有所不同。在第二步进行热处理（50℃， 30分钟）后，离心后将上清转移到离心管中，此时取离心管 中的上清约1.5ml，放在小离心管中，作为级分II。 • 乙醇沉淀后的固体蔗糖酶，等量分装在两个1.5ml的离心管中， 4℃下保存，做为下两次实验中的酶。