一、获取外源目的基因片段
2．1．1 TRIzol法提取流程图
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一、获取外源目的基因片段
2．2 mRNA的纯化
该方法利用mRNA 3＇端含有PolyA（多聚腺 苷酸）的特点，当RNA流经寡聚dT纤维素柱 时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异 性的结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗 脱mRNA。经过两次寡聚纤维柱后可得到较 高纯度的mRNA。
1．选择实验材料 胰岛素是一种蛋白质类激素，体内胰岛 素是胰岛B细胞（即胰岛β细胞）受内源 性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、 精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的。 胰岛素基因只有在胰岛B细胞中才能转 录出信使RNA，所以用基因工程方法生 产胰岛素时，选用胰岛B细胞为获取目 的基因的实验材料。
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基因工程制胰岛素三种方法
一、A链和B链分别表达法
化学合成 A链和B
链的编码
序列
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基因工程制胰岛素三种方法
一、A链和B链分别表达法
表达产
物的后
期处理 路线：
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基因工程制胰岛素三种方法
二、人胰岛素原表达法
基因工程菌的构建战略：
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基因工程制胰岛素三种方法
一、获取外源目的基因片段
2．提取RNA，分离RNA
2．1 总RNA的提取 2．2 mRNA的纯化
2．3 mRNA的保存
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一、获取外源目的基因片段
2．1 总RNA的提取
总 RNA 的抽提方法有多种， TRIzol 试剂是使用组广 泛的 RNA 抽提试剂，主要由苯酚和异硫氰酸胍组成， 可以迅速破坏细胞结构 ，使存在于细胞质及核内的 RNA 释放出来，并使核糖体蛋白与 RNA 分子分离。苯 酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制 RNA 酶活 性，因此TRIzol中还加入了 8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、 β- 巯基乙醇等来抑制内源和外源 RNase （ RNA 酶）。 TRIzol 是从细胞和组织中提取总 RNA 的即用型试剂， 在样品裂解或匀浆过程中， TRIzol 能保持 RNA 完整性。 提 取 RNA 时 ， 首 先 用 液 氮 研 磨 材 料 ， 匀 浆 ， 加 入 TRIzol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分。然后加 入氯仿抽提，离心，分离水相和有机相 ，收集含有 RNA 的水相，通过异丙醇沉淀，可获得比较纯的总 RNA，用于下一步mRNA的纯化。
二、人胰岛素原表达法
表达产物的后 期处理路线：
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基因工程制胰岛素三种方法
三、A链和B链同时表达
法
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基因工程制胰岛素三种方法
三种方法比较：
方法一： 由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二 硫键的正确配对率较低，通常只有10% - 20%，因此成 本高。
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一、获取外源目的基因片段
2．2．1 寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA （1）试剂准备： ① 3M醋酸钠（pH5.2）； ② 0.1M NaOH； ③ 上样缓冲液：20mM Tris-HCl（pH7.6）,0.5M NaCl,1M EDTA (pH8.0),0.1%SLS(十二烷基氨酸钠)。配制 时可先配制Tris-HCl（pH7.6）、NaCl、EDTA（pH8.0） 的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消 毒，冷却至65℃，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至 终浓度为0.1%； ④ 洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl（pH7.6），1mM EDTA （pH8.0），0.05%SDS； ⑤ 无水乙醇、70%乙醇； ⑥ DEPC（0.1%焦炭酸二乙酯）
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一、获取外源目的基因片段
2．1．1 TRIzol法提取流程 （1）样品处理① 培养细胞：收获细胞1-5*10^7，移入 1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol，混匀，室温静置5min。 ② 组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的 组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol充分匀浆， 室温静置5min。 （2）加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。 （3）4℃离心，12000g*15min，取上清液。 （4）加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置 10min。 （5）4℃离心，12000g*10min，弃上清液。 （6）加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃， 7500g*5min，弃上清液。 （7）晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65℃促溶1015min）。 2018/11/13 14
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一、获取外源目的基因片段
1．选择实验材料 2．提取RNA，分离RNA 3．逆转录mRNA,得cDNA第一链 4．得双链DNA 5．DNA序列纠错 6. 目的基因通过细胞克隆扩增 7. 目的基因回收及DNA测序，最终目的 基因获取
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一、获取外源目的基因片段
方法二： 胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确 配对率提高，折叠率高。工艺路线依然繁琐。
方法三： 需体外折叠。
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基因工程获取胰岛素的步骤
一、获取外源目的基因片段 二、选择与获取表达载体 三、重组目的DNA片段与表达载体 四、选择与获取表达细胞 五、重组体导入表达细胞 六、对重组体细胞进行筛选纯化鉴定 七、工程菌产物鉴定和保存 八、发酵培养
基因工程制胰岛 素(生工版)
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胰岛素是由胰岛B细胞受内源性或外源性 物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、 胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白 质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖 的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质 合成。外源性胰岛素主要用来糖尿病治 疗。胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因 子具有高度生物活性，分子量很大，立 体结构异常复杂，体外难以人工合成。 所以过去糖尿病患者只能服用从牛、猪 体中提取的胰岛素来治疗；但牛、猪胰 岛素结构上与人胰岛素有差别，如与猪 胰岛素B链第30个氨基酸残基不同，长期 服用会引起肾和眼的疾病，故必需要用 基因工程方法获得重组人胰岛素进行治 疗。