昆虫杆状病毒表达系统的分子基础
• 目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒 (Ac MNPV)、 家蚕核多角体病毒(BmNPV)、 黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒 (OpMNPV)、 舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒( Ld MNPV)、 甜菜夜蛾多核衣壳 核多角体病毒( Se MNPV)、 棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)以及斜纹夜蛾核 型多角体病毒( SplM t NPV) 杆状病毒在其生活史中共有两种形式的表型存在,在感染的初期( 0~ 24h), 主 要以细胞释放型病毒粒子( cell-released virus , CRV)为主, 也称为胞外型病毒 ( extracel lular vir us , ECV)或出芽型病毒 ( Budded vir us , BV); 在感染的晚 期主要以包埋型病毒( occlude d vir us , OV)的形式存在。杆状病毒的这两种 表型的形态、 蛋白组成、 病毒囊膜的来源、 感染组织特异性以及病毒入侵 宿主细胞的方式都不相同。 由于两种表型的病毒在结构组成上的差异, 所以杆状病毒在不同的时期需要表 达不同类型的蛋白来满足病毒颗粒不同形式的组装。昆虫杆状病毒的基因表 达共分为 4个时期: 极早期、 早期、 晚期、 迟晚期。4个时期的基因一环扣 一环,按时间先后, 以级联方式严格制约。早期表达的基因有 ie- 1、 me53、 pe38、 ie- 2等, 晚期表达的基因有 vp39 、vp80、 polh、 p10等, 这些不同的 基因所表达的蛋白各自具有不同的功能, 有些表达产物具有调控的功能, 而有 些仅仅只具有结构蛋白的作用。 在杆状病毒所表达的一系列蛋白中,有一类蛋白具有较高的表达量,并且均为病 毒基因组复制所非必需, 其中最具代表性的有多角体蛋白与 P10蛋白, 均属于 晚期表达的蛋白,受晚期启动子的调控。昆虫的杆状病毒表达系统正是利用了 这类蛋白的优点, 从而提供了外源 DNA插入座位。
表位标记与构建重组体注意事项
使用常用密码子 注意克隆位点（限制 性酶切位点）相符 5`端加上起始密码子 ATG 3`端加上终止密码子 用一种抗体可鉴别不同重组 可插入蛋白酶切位点 蛋白 不影响蛋白功能 基因，以利于产生天 有利于研究蛋白功能 然蛋白 常用表位：6His；FLAG； 其他常规构建载体的 LZ等 注意点
病毒基因组的结构特点
病毒基因组大小相差较大,与细菌或真核细胞相比，病毒 的基因组很小 病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成 多数RNA病毒的基因组是由连续的核糖核酸链组成 ，病 毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的 ，噬菌体（细胞 病毒）的基因是连续的；而真核细胞病毒的基因是不连续 的 ，无内含子 基因重叠即同一段DNA片段能够编码两种甚至三种蛋白 质分子，病毒基因组DNA序列中功能上相关的蛋白质的 基因或rRNA的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定 的部位,形成一个功能单位或转录单元 ，多顺反子 除了反转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体，每个 基因在病毒颗粒中只出现一次
杆状病毒_昆虫表达系统
杆状病毒基因组：闭环双链DNA，88-166kb 启动子：杆状病毒科核多角体病毒的多角蛋白强启动子 表达系统（两种）
杆状病毒表达系统（BEVS） 家蚕核型多角体病毒-家蚕表达系统
宿主：鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、脉翅 目、毛翅目的600多种昆虫 克隆基因方法：转移载体→共转染→同源重组→空斑筛选 →纯化→重组病毒
表位：抗原决定簇即抗原 分子于一特定抗体结合的 化学基团，一般由少至几 个氨基酸的多肽组成 用于重组DNA技术的示踪、 分析、纯化（亲和） 优点
基因导入的各种方法
光穿孔法：激光；悬浮细胞 冲击波：活体局部的基因转移 基因枪法：即微粒轰击；动物细胞，更适用于植 物细胞 穿孔法：脉冲电场；Cytomix缓冲液；70%细胞 死亡时效率最高 磷酸钙共沉淀法 脂质体法：Lipofectin；阳离子 抗体转染法：抗CD3，CD34或表面免疫求蛋白 其他：超声波法；微注射法原生质体融合法；反 转录病毒感染法
基因表达与调控
真核表达_昆虫杆状病毒表达系统
真核表达系统的种类和常用载体
1.真核表达系统的种类
酵母 丝状真菌 昆虫 哺乳动物细胞
2.真核表达载体
质粒：真核表达元件、 真核抗性
病毒载体：改建后
SV40病毒 腺病毒 反转录病毒 痘苗病毒
转基因动物
植物反应器
杆状病毒表达系统的局限性
• 1.无法进行连续性（高）表达 • 2.糖基化方式与哺乳动物存在一定差异 • 3.糖侧链甘露糖的成分较高，而复合寡糖缺 乏 • 4.功能基因组学的研究仍然比较薄弱 • 5.有关病毒晚期的高表达和调控机制等仍不 够明了 • 6.酵母筛选系统比昆虫细胞重组介质相对更 有优势，重组病毒与原病毒的混合增加筛 选难度
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杆状病毒表达系统优点
容量大：能插入12kb的外源基因 高表达：采用的polh基因启动子是目前所 知的最强的真核启动子；产物对宿主影响 小；产物可结晶 高效：可同时表达多个基因 安全：杆状病毒对脊椎动物无病原性 具加工修饰功能：昆虫细胞属较高等真核 细胞 家蚕表达系统中，家蚕易饲养
表达产物的检测技术
Western印迹法——免疫学方 法——抗原-抗体反应 荧光显微镜法——表位标记的 抗体与直接抗体进行荧光标 记——免疫学方法
• Western印迹法 蛋白样品制备→ SDS-PAGE（按
分子量大小）→电转移→一抗（特
异性）→二抗→显色 敏感度：1-5ng
杆状病毒-昆虫表达系统技术路线
构建真核表达系统_细胞必需表达元件
原核DNA序列 启动子 增强子 拼接信号 终止子和多聚腺苷化信号 筛选标记 动物病毒基因序列
病毒载体优点
真核细胞可识别的启动子 报告基因 感染周期，可持续复制 部分载体可整合入基因组 部分载体本身带有完整的 复制及表达元件 部分载体具有宿主细胞特 异性
SV40病毒
• 《SV40》(Simian vacuolating virus 40 or Simian virus 40)是猴空泡病毒40，猿猴病毒40或猴病毒 40的缩写，多瘤病毒科，这是在人类和猴子都发 现的致瘤病毒。SV40病毒的基因组是一种环形双 链的DNA，基因组5.2kb，病毒的直径45nm，病 毒成熟部位细胞核，无被膜，62个核壳粒亚单位， 这种大小很适于基因操作。同时它也是第一个完 成基因组DNA全序列分析的动物病毒。
识别受体 假病毒颗粒
• 杆状病毒及其基因组模型
昆虫杆状表达系统简介
• 杆状病毒是已知昆虫病毒中最大的类群 ,发现最 早 、研究最多且实用意义很大的昆虫病毒。20世 纪80年代以来由于杆状病毒表达载体系统 （baculovirus expression vector system，BEVS） 的建立 ,已被公认为是当今基因工程四大表达系统 之一 。该系统具有许多优点,如多角体启动子控制 下的高效表达 ,完善的转译后加工修饰 ,较易从无 血清培养上清中纯化的蛋白,无内毒素污染等。 • 杆状病毒载体系统主要分为两大类,一类是用于表 达单个外源基因的载体,另一类是多元表达载体,用 于插人并表达2个或多个外源基因
病毒复制（SV40示例）
• 以单纯疱疹病毒为例。 （1）病毒与细胞结合； （2）病毒进入细胞，去 包膜；（3）脱壳；（4） 病毒DNA进入细胞核； （5）病毒基因组复制， 合成子代病毒及病毒 mRNA；（6）以病毒基因 转录的mRNA进入细胞质； （7）病毒mRNA翻译病毒 子代蛋白，包括早期蛋白 和晚期蛋白；（8）装配 子代病毒；（9）出核， 同时披上包膜；（10）释 放到胞外
• BEVS通常由转移载体、亲本病毒和重组介质三部分组成, 其技术路线分以下几步:先将外源片段克隆到载体质粒中, 置于杆状病毒启动子控制之下, 上下游各有一段与亲本病 毒DNA 相匹配的侧翼序列, 构建成转移载体; 然后把转移 载体和野生型病毒共转染入昆虫细胞,通过同源重组将外 源片段插入到病毒基因组,再以特定的筛选标记和方法获 得重组病毒。由于病毒原来的非必需区段被外源片段取代, 当重组病毒在受体细胞内复制时,外源片段也得到了表达。 最后空斑纯化重组病毒, 扩大培养,分离、 纯化所表达的外 源蛋白。 • 技术路线英文参考文献：CHRIS TOPHER D R. Baculovirus expression protocols [ M ] . Totowa: Humana Press Inc, 1995: 12-23.
重组杆状病毒表达载体的构建
杆状病毒表达系统的应用
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杆状病毒表达系统的部分改进
• 1.用病毒早期启动子与晚期启动子以及嵌合与修饰启动子，让杆状病 毒系统持续表达 • 2.通过亲本病毒的线性化，非必需基因的缺失以增加外源基因表达途 径来大大提高重组病毒筛选效率与稳定性 • 3.杆状病毒穿梭载体bacmid（Baculovirus plasmid，杆状病毒质粒） 的构建，可被修饰并在原核细胞与真核细胞之间穿梭表达。 Bac-toBac system。这一方法利用了转座酶将外源基因转座到病毒基因组的 特异性位点, 重组后的病毒基因组现在被俗称为 Bacmid 。在 Bacmid 中, 外源基因被核多角体启动子控制, 并包含了不同的抗性基因及 LacZ缺失标记, 极大地方便了重组病毒的筛选及鉴定。 • 4.病毒滴度测定方法的改进，传统的病毒滴度测定方法是利用噬菌斑 试验, 这一方法极为突出的缺点是所需时间较长，报告蛋白来进行滴 度的测定, 如绿色荧光蛋白及半乳糖苷酶等。这些方法共有的缺点是 需要额外表达一个蛋白。用western印迹法，荧光显微镜法