SDSSDS软件的介绍
Setup Instrument Results
Plate Spectra Component Amplification plot Standard Curve Dissociation Report
Spectra （光谱）选项卡显示所选反应孔的荧光光谱。 用鼠标指针点击并拖动 Cycles （循环）滑块上的指示器， 可查看每一循环的光谱。 Cycle（循环数）文本框中显示滑块指示器的当前位置。
常见的荧光染料
FAM
HEX TET JOE TAMRA ROX SYBR® green I
不同荧光染料的纯光谱
基线
Baseline: The initial cycles of PCR during which there is little change in fluorescence signal(usually cycles 3 to 15).
阈值设置太低
阈值设置在扩增曲线的指数增长期之下。其标准误差远 高于正确设置阈值时图谱的标准误差。向上拖动阈值条， 使之处于扩增曲线的指数增长期内。
阈值设置太高
阈值设置在扩增曲线的指数增长期之上。其标 准误差远高于正确设置阈值时图谱的标准误差。 向下拖动阈值条，使之处于扩增曲线的指数增 长期内。
手动调整阈值
实验中的对照
NTC(No template controls) Positive control Negative control
不同的反应液对比
产生的△Rn值也不同。
本底荧光信号基线属于非 模板依赖的因素，两种反 应液的基线是不同的。 Ct值的变化并没有反映出 反应体系的总体效果
基线设置太高
扩增曲线从最大基线之前开始。应减小 End Cycle （结束循环）的值。
阈值(Threshold)
对于一个样品，当荧光信号超过阈值可以被检 测到。 通常3～15个循环的荧光信号（基线）的标准 偏差的10倍。 一般软件计算给出，可以手动调整。 指数期 大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值
Component （成分）选项卡 显示整个 PCR 运行期间所选反应孔的每种荧 光的完整光谱表现。每次只能显示第一个选取 的反应孔。
Rn vs. Cycle (Linear) （Rn 随循环变 化，线性）
ΔRn vs. Cycle (Log) （ΔRn 随循环变 化，对数）视图
曲线分析
荧光PCR结果分析
Kary Mullis

PCR及有关技术的发展历史
1983 Cetus 公司的 K. Mullis在这 年底（12月16日第一次成功实验）发明了 PCR。 “这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷 贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下， 即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路 上时想出来的”。
TaqMan-5’ Nuclease Assay
TaqMan名字的由来 从一个游戏PacMan (Namco) Pac-Man是一款80年 代经典吃豆游戏
PCR扩增分四个区
开关机顺序
按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪 器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。 开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再 开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯 亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实 验。 关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭 信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的 电源，最后关闭电脑。
Typically 1-2 cycles beforethe reporter dye signal begins to increase.
基线设置正确
扩增曲线从最大基线之后开始。不需要进行调整。
基线设置太低
扩增曲线从远离最大基线的右侧位置开始。 应增大 End Cycle （结束循环）的值。
灵敏度相当的反应液产生 的Ct绝对值可能不同。
标准曲线
Standard curve: Obtained by plotting Ct values against log-transformed concentrations of serial ten-fold dilutions of the target nucleic acid.
Ct值(threshold cycle)
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设 定的阈值时所经过的扩增循环次数
与加入样品拷贝数的对数成线形关系 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少， 即Ct值越小。
阈值设置正确
阈值设置在扩增曲线的指数增长期之内。 高于或低于最优化值的阈值设置将会增大重复组的标 准偏差。
PCR只是一个简单的不起眼玩艺 PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR 概念变成了可操作的实验系统，变成了一项 成熟的技术。 它最大的特点就是能不断推出新形式。
实时荧光PCR技术发展历程
1991年Cetus公司的Holland等在Proc Natl Acad Sci U S A 上发表了TaqMan® probes 技术。 1993年美国Applied Biosystems, Division of Perkin-Elmer 的Lee 等在Nucleic Acids Research杂志上发表了使用双荧光标记的实时 荧光PCR方法。 1996年美国纽约公共卫生研究所(Public Health Research Institute) Tyagi和 Kramer在Nat Biotechnol上发表了分子信标 (Molecular beacons)方法。
总结
检测 基线 阈值 NTC 对照 样品
谢谢！