$国家自然科学基金申请书（2 0 1 6 版）资助类别：青年科学基金项目亚类说明：附注说明：项目名称：Poly(A)化GANT61纳米颗粒靶向治疗胶质瘤的实验研究"申请人：电话：依托单位：^通讯地址：邮政编码：/单位电话：电子邮箱：; 申报日期：国家自然科学基金委员会基本信息国家自然科学基金申请书项目组主要参与者（注: 项目组主要参与者不包括项目申请人）编号姓名出生年月性别职称学位单位名称电话电子邮箱证件号码每年工作时间（月）总人数高级中级初级博士后博士生硕士生第 3 页国家自然科学基金项目资金预算表预算说明书（定额补助）、（一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）：1.项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。

附主要参考文献目录）；1.1研究意义胶质瘤 (glioma) 是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤之一，约占儿童脑肿瘤的25%。

具有生长迅速、手术难以彻底切除的特点。

近年来开展的以手术切除并结合放化疗的综合治疗仅能治愈部分病例，还有相当多的胶质瘤患者治疗后遗留神经系统功能缺陷和认知障碍，严重影响着患者的生存质量。

因此，对胶质瘤的靶向治疗和分子机制的深入研究，将为治疗胶质瘤的治疗提供更多的理论依据和实验基础。

寻找治疗GB 更安全有效的方法，并尽可能减少后遗症是十分必要的，具有重大的社会意义。

SHH 信号通路（Sonic Hedgehog Pathway, SHH）的传递过程可以简单总结四个部分：Sonic Hedgehog（SHH 配体蛋白）- Ptch（跨膜蛋白受体）- Smo（跨膜蛋白）- Gli（转录因子）的传递过程。

Gli 是该信号通路下游终末端的转录因子，调控着下游 CyclinD1、N-myc、PTCH1、bcl-2 和 bax 等多个靶基因。

GANT61 是该通路下游的 Gli 抑制剂，它主要与 Gli1DNA 结合，抑制 Gli1、Gli2 锌指蛋白活性，从而拮抗 SHH 信号通路 Smo 下游 Gli1 等转录因子的转录活性。

虽然多项研究表明 GANT61 能够明显抑制肿瘤的生长增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，但 GANT61 同样也存在着一定的缺点，如何提高药物的靶向运输，提升治疗效果，降低药物的不良反应等一系列问题，都需要通过一种新型的载体材料来解决。

1.2国内外研究现状及发展动态分析随着新世纪生物材料科学的发展，功能化的纳米材料在肿瘤的治疗方面存在着广阔的应用前景。

通过构建纳米药物载体，能够实现药物精准的控制释放，提高药物的靶向运输效率和治疗效果，并且能够大大减少药物的不良反应。

同时，聚腺嘌呤(PolyA) 广泛存在于生物体中，和生命的活动息息相关，尤其是在 RNA 的转录和翻译之中发挥着重要作用。

而且，许多肿瘤细胞的 mRNA 末端往往存在着过度表达(PolyA)尾端。

很多研究发现，利用 mRNA 末端的Poly(A)作为药物靶点，其能够通过与药物的氢键特异结合，可以抑制 mRNA 的翻译，从而抑制肿瘤的发生发展。

同时，由于氢键结合力介于共价结合和静电吸附之间，在一定的条件下(如低 pH、升温)，其结合力将会下降。

因此，利用 Poly(A)能够和药物之间相互作用的特点进行装载药物，可能会成为一种新型的抗肿瘤药物载体。

因此，利用小分子 GANT61 化合物与腺嘌呤(A 碱基)氢键特异性结合，并在酸性环境下结合力将会下降的特点，同具有良好生物相容性、DNA 酶切保护性以及易于生物修饰的二氧化硅纳米颗粒相结合，研究一种基于(PolyA)和二氧化硅纳米颗粒 (Silica coated nanoparticles, SiNPs) 的，并且能够通过肿瘤的酸性环境进行可控性的释放抗肿瘤药物，将是一种更新型、更有效、更安全和更有前景的治疗方式，对胶质瘤的治疗过程具有重要意义。

2.项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题（此部分为重点阐述内容）；2.1研究内容(1)在体外分离培养 DOAY 细胞，研究 GANT61 对胶质瘤 DOAY 细胞增殖抑制的影响，通过流式细胞术检测 GANT61 对胶质瘤的促凋亡作用， Western blot 和qPCR 等实验研究胶质瘤中DOAY 细胞SHH 信号通路中Gli1、Gli2、CyclinD1、Caspase3、Caspase9、Bax、Bcl-2 等表达情况。

(2)成功构建 Poly(A)化 GANT61 纳米颗粒。

分别通过高分辨电镜、高效液相色谱法检测、CCK8 法和激光共聚焦研究等实验研究合成纳米颗粒的表面特征、纳米颗粒药物的包封率和载药量、细胞的抑制率和细胞的吞噬及释放。

(3)制作胶质瘤裸小鼠移植瘤模型，使用构建成功的Poly(A) 化GANT61 纳米颗粒颈内动脉注射移植裸小鼠胶质瘤进行动物实验，Westernblot、免疫组化及 qPCR 等实验研究胶质瘤中SHH 信号通路中Gli1、Gli2、CyclinD1、Caspase3、Caspase9、Bax、Bcl-2 等表达情况。

2.2研究目标(1)在体外培养胶质瘤 Doay 细胞，研究 SHH 信号通路靶向抑制剂GANT61 对胶质瘤 Doay 细胞增殖抑制的影响。

(2)合成 Poly(A)化 GANT61 纳米颗粒，分别通过高分辨电镜、高效液相色谱法检测、CCK8 法和激光共聚焦研究等实验研究合成纳米颗粒的表面特征、纳米颗粒药物的包封率和载药量、细胞的抑制率和细胞的吞噬及释放。

(3)Poly(A)化 GANT61 纳米颗粒靶向治疗裸鼠胶质瘤，再使用免疫组化、westen blot 和 qPCR 检测胶质瘤中 SHH 信号通路中相关蛋白和基因的表达情况。

2.3拟解决的关键科学问题1、在体外构建建立 Poly(A)化 GANT61 纳米颗粒合成，目前我们已经进行了相关的研究。

2、使用透射电子显微镜、电泳、高效液相色谱仪等方法检测纳米颗粒的形貌、电位、稳定性、载药量、包封率以及考察 GANT61 在不同 pH 值溶液的释放行为。

再通过激光共聚焦扫描仪考察细胞对颗粒的吞噬以及吞噬后颗粒的定位。

3、建立裸鼠的胶质瘤模型具有一定的技术困难，本课题组已经在前期准备工作中进行了初步的研究。

3.拟采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）；3.1研究方案（1）细胞培养细胞培养在体外分离培养 DOAY 细胞，胶质瘤 Doay 细胞株在含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基于 37℃、5%CO2 恒温孵箱进行贴壁培养，每 2－3 天根据细胞生长的密度和培养液酸碱度的变化更换培养液，当细胞汇合度达 80－ 90%时进行传代培养，传代培养时根据细胞生长情况进行 1:2 或 1:4 的传代。

实验前用台盼蓝染色法鉴定细胞活力在 98%以上。

（2）SHH 信号通路抑制剂 GANT61 对胶质瘤 DOAY 细胞的靶向抑制作用。

研究 SHH 信号通路抑制剂 GANT61 对胶质瘤 DOAY 细胞增殖抑制的影响，通过流式细胞术检测 GANT61 对胶质瘤的促凋亡作用，并使用 qPCR、westerblot及免疫荧光进行分别检测SHH信号通路中相关蛋白的表达情况：Gli1、 Gli2、CyclinD1、Bcl-2、Bax 及 Caspase3 等。

（3）构建 Poly(A)化GANT61 纳米颗粒采用反向微乳法合成羧基化二氧化硅纳米颗粒(COOH—SiNPs)。

将环己烷 7 ml、正己醇 ml 以及表面活性剂 Triton X-100 2ml 混合均匀后，加入500 μl超纯水于常温下搅拌 30 min，再将100 μl 氨水和 100 μl TE OS加入到微乳液体系中，连续搅拌 24 h。

然后加入60μl羧基硅烷化试剂 (CPTES)，于室温下继续搅拌反应24 h 后，破乳、离心分离颗粒，获得 COOH—SiNPs 颗粒。

采用 EDC／NHS 交联方法将Poly(A)修饰到COOH-SiNPs 表面。

取2mg COOH—SiNPs 分散于1 mL MES缓冲液中，加入NHS和ED C，在上述混合液中再加入 nmol Poly(A)，于室温下振荡 8h 后离心收集颗粒，用超纯水洗涤 3 次，即得到Poly(A)-SiNPs，采用琼脂糖凝胶电泳法考察 Poly(A)是否成功修饰在二氧化硅纳米颗粒表面。

取2 mg Poly(A)／SiNPs 颗粒分散在1ml 50 μM/L GANT61 溶液中，于室温中振荡 1 h 后离心收集颗粒，用超纯水洗涤 3 次，即得到 Poly(A)化GANT61 纳米颗粒。

（4）CCK8 法Poly(A)化 GANT61 纳米颗粒的生物相容性以及对癌细胞杀伤效果。

Doay 细胞培养生长状态良好时，消化细胞制成单细胞悬液。

细胞计数后以2×104 细胞接种于 96 孔板，37℃、5%CO2 培养过夜。

第二天，更换新鲜的DMEM培养基，并分别设置不同浓度的 Poly(A)化 GANT61 纳米颗粒组、Poly(A)-SiNPs 组、GANT61 组及空白对照组，分别设置加了相应量细胞培养液、药物和 CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。

在细胞培养箱内继续孵育，每孔于加药后 24h、48h 加入 CCK-8 溶液10μl，并终止反应，用酶标仪测定 450nm 处吸光度值，用所测得的 A450 计算细胞增殖抑制率。

细胞增殖抑制率=(对照组A450 值-实验组 A450 值)/对照组 A450 值×100%。

上述实验分别在 1 天、1 周、2 周和3 周检查。

（5）激光共聚焦研究 Poly(A)化 GANT61 纳米颗粒的细胞吞噬与释放研究为了考察 Poly(A)化 GANT61 纳米颗粒被细胞吞噬后的定位情况以及在细胞内部的释放行为。

将 DOAY 细胞接种于激光共聚焦皿内，然后将培养皿放入37℃， 5％C02 的培养箱中培养 12 h 后，加入荧光化 Poly(A)化 GANT61 纳米颗粒纳米颗粒继续孵育 5 h 后去除上清，用 D-hanks 清洗，然后利用 LysoTracker Green 溶液对细胞中的溶酶体进行标记，采用激光共聚焦显微镜对细胞进行成像观察载体在细胞中定位情况。

随后将皿放入培养箱继续培养 24 h 后，再进行激光共聚焦成像来考察颗粒在细胞内的释放行为。

（6）高分辨光镜及扫描电镜观察 Poly(A)化 GANT61 纳米颗粒首先用显微镜观察 Poly(A)化 GANT61 纳米颗粒表面形态特征，继而用TOSHIBA800S 扫描电镜,电压 20kV，每一规格测量 300 个微球直径，计算微球平均直径。