浙江省自然科学基金申请书浙江省自然科学基金委员会二OO五年制基本信息项目组主要成员说明：1.个人介绍部分申请者必须填写，其他人员可以不填写；2.高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生及参加单位数由申请者负责填报，总人数自动生成；3.第一人必须是申请者，信息从前面自动读入，但每年工作时间必须手工录入。

个人介绍：申请经费预算万元注：开支范围和标准参见《浙江省省级科技项目经费管理暂行办法》（浙财教字[2002]20号）。

申请者承诺：我保证：（1）申请书内容是真实的；（2）恪守科学道德，伦理道德的基本原则；（3）项目组成员知晓申请书内容，并自愿参与研究工作；（4）已如实填报申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限；（5）如果获得资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守浙江省自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。

若填报失实或违反规定，本人将承担全部责任。

签字：日期：项目依托单位承诺:已按规定对申请人的资格和申请书内容进行了审核。

申请项目如获资助，我单位保证对计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守浙江省自然科学基金委员会有关规定，督促项目组遵守科学道德和伦理道德的基本原则，督促项目负责人和本单位项目管理部门按照规定及时报送有关材料。

依托单位公章日期.促红细胞生成素受体在心肌缺血再灌注过程中的表达及功能1、项目研究意义随着溶栓和急诊介入治疗的广泛开展，心肌梗死患者短期和长期的生存率得到显著提高，但仍有相当部分存活的患者随后发生进行性心力衰竭。

缺血/再灌注导致的心肌损伤是目前心机梗死治疗中有待解决的关键问题，有文献报道，心肌缺血/再灌注过程中凋亡的发生是导致心肌损伤的重要机制之一[1]。

凋亡是细胞程序性死亡，因此，可以通过早期干预减少凋亡的发生，从而降低心肌在缺血复灌过程中的损伤[2]。

在动物实验中已经证实，应用抗凋亡药物，细胞因子或采用基因治疗可减轻心肌缺血/再灌注损伤。

但目前某些抗凋亡方法尚不能应用于临床，而已有抗心肌再灌注损伤的临床试验未见显著的心肌保护作用[1]。

因此，有必要探索一种既可用于临床，又具有显著心肌保护作用的治疗方法，作为心肌梗死再灌注治疗的辅助治疗，以减轻心肌损伤。

促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）是第一个被克隆的造血生长因子，以往主要用于促进红细胞生成以纠正贫血，在临床上已被广泛使用十余年。

其造血活性的主要机制为抑制晚红系祖细胞凋亡而非直接刺激细胞生成[3]。

随着EPO受体在脑、肝脏、子宫等器官及实体肿瘤组织的发现，EPO的髓外作用日益受到重视[4]。

近十年的研究主要集中于EPO的脑保护作用， EPO/EPO受体通过抗凋亡、抗炎、抗氧化等机制，可预防或减轻神经系统缺血/再灌注损伤[5]。

一项已完成的EPO对缺血性中风病人安全性和疗效的随机双盲临床试验，对于中风8小时内的患者，连续3天经静脉使用重组EPO （recombinant EPO, rEPO），观察30天显示rhEPO对于急性缺血性中风患者能有效缩小梗塞面积和改善临床表现[6]。

同时在心肌细胞也发现EPO受体的存在。

已有研究表明EPO可在细胞水平显著减少缺氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡，同时器官水平研究表明EPO可减少缺血再灌注心肌损伤和梗死心肌的范围，改善心功能[7]。

在缺血再灌注的不同时期，包括心肌缺血前、缺血时及再灌注时使用单一剂量rEPO 均能产生显著心肌保护作用[8]。

由于单一剂量EPO治疗后3~5天才可见外周循环中红细胞增加，因此EPO的心脏保护作用与增加红细胞浓度无关，直接保护机制可能包括：（1）减少心肌细胞凋亡；（2）稳定内皮细胞和促进血管生成[9]；（3）动员骨髓内皮祖细胞[10]；（4）减轻缺血和再灌注引起的炎症反应[11]等。

体内EPO主要由肾脏分泌入循环，EPO和细胞膜的EPO受体结合发挥生物活性，激活多种信号转导途径发挥抗凋亡作用[12]。

多种神经细胞可分泌EPO和表达EPO受体，EPO/EPO受体系统被认为是脑缺血损伤的内源性保护机制，在脑缺血/再灌注或持续局部脑缺血时，神经细胞上调EPO受体和分泌EPO 增强，并且上调EPO受体要早于增加EPO分泌[13，14]。

EPO受体在成年大鼠心肌细胞、内皮细胞和纤维母细胞均有表达[15]，细胞EPO受体表达可能与缺氧，胰岛素样生长因子（insulinlike growth factor, IGF），肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF），白介素-1（interleukin, IL-1）和白介素-6（interleukin6, IL-6）等有关[4]。

目前尚无心肌组织分泌EPO的证据，调控心肌细胞EPO受体表达的因素尚不明确，对于心肌梗死时是否也存在EPO受体上调尚不清楚。

EPO受体的表达分布和时间，对于外源性EPO的治疗效果起决定作用。

在大鼠离体心脏Langendorff 灌注模型中，40min缺血和2h再灌注，EPO受体的表达量和在心肌细胞内皮细胞和纤维母细胞的表达分布未见显著改变，并且发现外源性EPO治疗使心肌组织EPO受体下调[15]。

是否持续缺血或更长的再灌注时间能使EPO受体的表达量和分布产生影响，以及EPO治疗是否会导致EPO受体持久下调等情况，需进一步研究。

本项目研究缺血性心脏病时EPO受体的表达和功能。

重点探讨心肌细胞表达EPO受体的调控机制，缺血和再灌注损伤时心肌组织EPO受体表达分布和时间特征，以及外源性EPO的心脏保护作用与心肌EPO受体功能的关系。

同时，观察外源性EPO治疗对于心脏EPO受体表现情况影响等。

通过研究以明确缺血性心脏是否存在EPO/EPO受体的内源性保护机制和外源性EPO治疗的最佳时间窗，为临床使用EPO 治疗急性心肌缺血性损伤提供实验依据。

2、项目研究目标及与申请者研究工作长期目标的关系研究目标：探索心肌细胞表达EPO受体的影响因素，明确心肌缺血损伤时是否存在EPO/EPO受体的内源性保护机制。

探索外源性EPO对于心肌保护作用及与EPO受体表达的关系，明确EPO治疗的时间要求。

EPO 治疗缺血性心脏病提供实验依据。

与申请者研究工作长期目标的关系：本课题组成员长期从事心血管疾病治疗和细胞移植治疗的研究，在心血管生理学、细胞生物学分子生物学、分子遗传学和病理学等方面做了大量的工作，积累了丰富的理论和实践经验。

3、项目研究内容，研究方案和进度安排研究内容：第一部分：体外实验：大鼠心肌细胞EPO受体表达及影响因素1、低氧及IL-6等细胞因子对体外培养的心肌细胞EPO受体表达的影响：观察体外培养的心肌细胞EPO受体表达情况，以及在低氧和/或与心肌梗死相关的IL-6等细胞因子对于心肌细胞EPO受体表达的影响。

2、外源性EPO对缺氧心肌细胞损伤的保护作用及EPO受体的表达变化：观察外源性EPO对于心肌细胞的保护作用，以及EPO处理对于心肌细胞表达EPO受体的变化。

第二部分：在体实验：缺血损伤对于心肌细胞表达EPO受体的影响1、缺血性损伤时心肌表达EPO受体改变及分布：观察缺血再灌注及心肌梗死模型中缺血区域心肌细胞、内皮细胞及间质细胞表达EPO受体情况及随时间的改变。

2、缺血性心肌损伤时循环中EPO浓度改变及时间特征：观察缺血再灌注及心肌梗死时循环中EPO 浓度改变，随时间的浓度曲线，以及与EPO表达相关的细胞因子水平的改变。

3、外源性EPO对缺血心肌的保护作用及对EPO受体影响：观察外源性EPO对于缺血再灌注及心肌梗死的保护作用和EPO治疗开始时间及维持治疗对于保护作用的影响。

观察外源性EPO对于缺血心肌表达EPO受体的影响。

研究方案：第一部分体外培养的心肌细胞EPO受体表达及影响因素1、新生大鼠心肌细胞原代培养，光镜及免疫细胞化学染色鉴定；2、低氧、低糖、TNF、IL-6、EPO等单一或复合条件下培养心肌细胞，使用半定量RT-PCR，Western Blot和免疫细胞化学染色检测EPO受体表达情况。

并与正常条件培养的心肌细胞对照。

3、低氧条件下培养的心肌细胞中加入不同浓度的rEPO，TUNEL法检测凋亡细胞，免疫细胞化学染色检测凋亡细胞和存活细胞表达EPO受体表达情况。

第二部分缺血损伤对于心肌细胞表达EPO受体的影响1、钳夹3min或结扎大鼠前降支分别建立大鼠心肌缺血/再灌注和心肌梗死模型。

2、再灌注或心肌梗死即刻、2h、6h、12h、24h、4d、7d等不同时间，使用半定量RT-PCR，WesternBlot和免疫组织化学染色检测EPO受体表达情况，同时以免疫组化确定细胞类型：心肌细胞（TnT、Cardiac myosin）、内皮细胞（VE-cadherin, factorⅧ）、血管平滑肌细胞（anti-a-smooth muscle myosin）及疤痕组织（1型和3型胶原抗体混合物）的特异性抗原。

TUNEL法检测凋亡细胞。

检测不同的时间点血浆EPO及IL-6等细胞因子浓度的变化。

3、分别在建立模型前、再灌注或心肌梗心即刻、心肌梗死后3h、6h等不同时间点开始皮下注射不同浓度的rEPO（1000-5000U/Kg，单交或1/d*7），以假手术组和生理盐水治疗组为对照。

4、不同时间获取大鼠心脏，观察心功能主要参数改变，观察梗塞区域病理变化，测定梗死面积，原位凋亡检测和EPO受体抗体双染色检测相关区域凋亡细胞数量，以及EPO受体表达的关系。

关键技术：（1）具有心肌细胞细胞原代培养、细胞移植、基因治疗及动物体内实验等相关研究经验和技术。

（2）本校动物实验、病理检测、细胞分类鉴定、凋亡检测及其他实验条件已具备，可配合实验的完成。

（3）免疫组织化学双抗体染色：可能出现两种抗体染色过程相互干扰，拟根据不同的细胞特导性抗体和EPO抗体双染色，摸索最佳的实验方案。

研究进度计划：整个研究需要3年完成（1）~心肌细胞原代培养，低氧及细胞因子等条件下心肌细胞表达EPO受体的改变。

（2）~EPO对于体外培养心肌细胞的缺氧损伤保护作用及对于EPO受体表达的影响。

（3）~在大鼠心肌缺血/再灌注和心肌梗死模型中观察EPO受体表达情况，外源性EPO对心肌的保护作用及对受体表达的影响。

总结实验资料、撰写论文。

技术路线：体外实验在体实验4、项目创新之处（1）EPO被认为具有多种器官的保护作用。

脑缺血损伤时，EPO/EPO受体上调发挥内源性保护机制，目前对于心肌缺血时是否存在同样的内源性保护机制尚不清楚。

本项目探索心肌缺血/再灌注损伤时EPO受体表达的改变，以明确是否存在内源性的EPO心肌保护机制。

（2）已有的研究主要观察EPO对心肌缺血时的保护作用及信号途径，对于EPO受体在心肌组织中的表达分布及缺血时的表达改变情况尚未见系统研究。