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培养基配制及消毒与灭菌及LB培养基制备资料讲解
培养基的配制及消毒与灭菌及 LB培养基的制备
一、实验目的
1 了解培养基的种类、掌握培养基的配制、 分装方法和灭菌前的准备工作;高压灭菌 的原理、使用范围和注意事项。
2 明确培养基的配制原理。 3 通过对LB培养基的配制,掌握配制培养基
的一般方法和步骤。
• 培养基是人工地将多种物质按各种微 生物生长的需要配制而成的一种混合 营养基质,用以培养或分离各种微生 物。因此,营养基质应当有微生物所 能利用的营养成分(包括碳源、氮源、 能源、无机盐、生长因素)和水。根 据微生物的种类和实验目的不同,培 养基也有不同的种类和配制方法。
• 由于这种培养基多用于培养细菌,因 此,要用稀酸或稀碱将其pH调至中性 或微碱性,以利于细菌的生长繁殖。
• LB培养基的配方如下:酵母提取物 5g、蛋白胨 10g、NaCl 5g、琼 脂 15~20g、水 1000mL、pH 7.4~ 7.6
三、实验器材
• 酵母提取物,蛋白胨, NaCl,琼脂; 1mol/L NaOH, 1mol/L HCl;试管,三角 烧瓶,烧杯,量筒,玻棒,培养基分装器, 天平,牛角匙,高压蒸汽灭菌锅,pH试纸 (pH 5.5~9.0),棉花,牛皮纸,记号笔, 麻绳,纱布等。
6.包扎
• 加塞后,将全部试管用麻绳捆扎好,再在棉塞外包一层牛 皮纸,以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞,其外再用一道麻绳 扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶 加塞后,外包牛皮纸,用麻绳以活结形式扎好,使用时容 易解开,同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
7.灭菌
• 将上述培养基以1.05kg/cm2(15磅/英寸2),121.3℃, 20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌,则应 放入冰箱内暂存。
按成分的不同分类
1.天然培养基:主要成分是复杂的天然有机物质, 如马铃薯、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等。 这些复杂天然有机物质的成分不完全了解,每次 所用的原料,其中各成分的数量也不恒定。这类 培养基是实验室常用的培养基,例如牛肉膏蛋白 胨培养基、马铃薯培养基等。
2.合成培养基:用化学成分完全了解的纯试剂配制 而成的培养基,如高氏1号培养基,查氏培养基等。 一般用于营养代谢、分类鉴定、菌种选育、遗传 分析等。
四、实验步骤
1.称量
• 按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、蛋白胨、 NaCl放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮,在称取时动作要迅 速。另外,称药品时严防药品混杂,一把牛角匙用于一种 药品,或称取一种药品后,洗净、擦干,再称取另一药品, 瓶盖也不要盖错。
2.溶化
• 在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量,用玻棒搅匀, 然后,在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后,补 充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基,将称好的 琼脂放入已溶化的药品中,再加热溶化,在琼脂溶化的过 程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足 所失的水分。
4.分装
• (1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。
• (2)固体分装分装试管,其装量不超过管高的1/5,灭菌后 制成斜面,分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一 半为宜。
• (3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜,灭菌后垂 直待凝。
5.加塞
• 培养基分装完毕后,在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞, 以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染,并保证有良 好的通气性能。
8.搁置斜面
• 将灭菌的试管培养基冷至50℃左右,将试 管棉塞端搁在玻棒上,搁置的斜面长度以 不超过试管总长的一半为宜。
9.无菌检查
• 将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养 24~48小时,以检查灭菌是否彻底。
五、实、能源、无机盐及生长因子的来源 • (2) 使用高压灭菌锅的注意事项 2 思考 • (1)培养基配好后,为什么摇立即灭菌? • (2)为什么配置培养基时要注意各营养成
• 3.鉴别培养基:是一类含有某种特定化合物或试 剂的培养基。某种微生物在这种培养基上培养后, 它所产生的某种代谢产物与这种特定的化合物或 试剂能发生某种明显的特征性反应,根据这一特 征性反应可以将某种微生物与其他种微生物区别 开来。主要用于不同类型微生物的快速鉴定,如 用来检查细菌能否产生硫化氢的醋酸铅培养基。
3.调pH
• 在未调pH前,先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值, 如果pH偏酸,用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH, 边加边搅拌,并随时用pH试纸测其pH值,直至pH达7.6。 反之,则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头, 以避免回调,否则,将会影响培养基内各离子的浓度。对 于有些要求pH值较精确的微生物,其pH的调节可用酸度 计进行(使用方法,可参考有关说明书)。
• 4.选择培养基:利用微生物对某种或某些化学物 质的敏感性不同,在培养基中加入这类物质,抑 制不需要的微生物生长,而利于所需分离的微生 物生长,从而达到分离或鉴别某种微生物的目的, 如分离真菌的马丁氏培养基。既有选择作用又有 鉴别作用的培养基,如鉴别肠道杆菌的远藤氏培 养基等。
二、基本原理
• LB培养基是一种应用最广泛和最普通的细 菌基础培养基,有时又称为普通培养基。 它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。碳源 和能源:酵母提取物,氮源:磷酸盐、蛋 白胨,无机盐:NaCl。在配制固体培养基 时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在 常用浓度下96℃时溶化,一般实际应用时 在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化, 以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固,通常 不被微生物分解利用。
按培养基的用途分类
• 1.基础培养基:含有一般细菌生长繁殖需 要的基本的营养物质。最常用的基础培养 基是上面提及的天然培养基中的牛肉膏蛋 白胨培养基。这种培养基可作为一些特殊 培养基的基础成分。
• 2.营养培养基(加富培养基):在基础培 养基中加入某些特殊营养物质,如血液、 血清、酵母浸膏或生长因子等。用以培养 对营养要求高的微生物,如培养百日咳杆 菌需要含有血液的培养基。