8.1引言近年来手性色谱领域的发展，使对映体的分离逐渐趋向于正规化，环糊在这方面起着重要作用。

环糊精由villiers于1891年发现，由于它没有还原性和能被酸分解，在外形上又与纤维素十分相似，所以称为木粉（cellulosine）[1]。

12年后，schardinger首次鉴定出环糊精是一种低聚糖，同时详细地叙述了它的制备和分离方法[2,3]。

Schardinger还成功的分离出纯芽孢杆菌，取名纯化芽孢杆菌（bacillus macerans）至今仍是环糊精生产和研究中经常用的菌种。

环糊精可以由水解液选择性的分离，也可用吸附色谱和纤维素柱色谱分离和鉴定环糊精[4]。

Freudenberg等人认识到了环糊精配合物的稳定性[5].此后对环糊精及其配合物特性的研究进行了大量的研究工作。

目前高效液相色谱环糊精键合固定相，衍生化环糊精键合固定相，在对映体分离领域中已成为很有用的工具。

环糊精（cyclodextrin,CD）是由一定数量的葡萄糖单元通过α－1,4葡苷连接的环状分子结构。

由所含葡萄糖单元的个数不同，可分为α－CD,β-CD ,γ-CD . α－CD含有6个葡萄糖单元，β-CD含有7个葡萄糖单元，γ-CD含有8个葡萄糖单元。

目前还未发现少于6个葡萄糖单元的环糊精，已鉴定出多于8个葡萄糖单元的环糊精，某些支化结构的环糊精已有报告[4]。

环糊精的分子示意图类似于厚壁截顶圆锥筒（见图8.1）。

图8.1环糊精结构n＝1，α－CD；n＝2，β-CD；n＝3，γ-CD每个葡萄糖单元的2,3位仲羟基在环的大口一方，6位伯羟基在环的小口一方。

环的内侧是由氢原子和成桥氧原子形成的，所以环的内侧具有相对疏水性。

环糊精分子中每个葡萄糖单元含有5个手性碳原子。

因此α-CD，β-CD，和γ-CD 就分别含有30，35，40个手性碳原子。

环糊精最突出的特点是能与许多有机分子形成包容配合物(inclusion complex),即客体分子部分或全部进入CD的空腔[5].环糊精的物理性质列在表8.1中表8.1环糊精的物理性质环糊精葡萄糖单元分子量腔尺寸水溶性,M外径内径深度α－CD697313.7 5.77.80.114β-CD 7113515.37.87.80.016γ-CD 8129716.99.57.80.179环糊精液相色谱固定相的发展大致可分为环糊精聚合物固定相，环糊精键合固定相，衍生化环糊精固定相或多模式环糊精固定相几个阶段。

1965年，Solms和Enli[6]合成出了保留环糊精包合作用性能的CD聚合物，他们把环糊精与3-氯－1,2还氧丙烷反应，得到适用于液相色谱标准粒径的不溶性聚合物的固定相。

这种固定相对溶质的保留是CD-溶质包合常的函数，且对大量的天然产物，香料，芳香酸，核酸等有分离能力。

其缺点是机械强度差，不能在高压下操作。

以后的研究多集中在如何将环糊精连接在硅胶上，得到能在高压下使用的环糊精键合固定相。

1983年，Fujimura [7]和Kawguchi [8]合成出了硅基氨和酰胺键合固定相，但该固定相稳定性差，易水解。

1985年,Armstrong 研究组[9]合成除了不含硫,氮的环糊精手性固定相,这类固定相稳定性好，不易水解，目前这些稳定的固定相已作为Cyclobond 商品出售，Cyclobond 分别为β-CD，α-CD和γ-CD，对位置异构体和光学异构体都有很好的拆分能力。

但是这类环糊精固定相只有在反相条件下才能使用才能有分离能力。

在正相条件下，由于流动相中的非极性分子占据了环糊精内腔，使得溶质分子很难进入内腔，因而不能对溶质包合。

对于手性化合物常常没有拆分能力，限制了它的应用范围。

为了克服环糊精键合固定相存在的上述不足，Hattori[10,11]报道了两种氨基改性的环糊精手性固定相。

发展出了衍生化的环糊精固定相。

Fujimura[12]合成出了两种氨基甲酸酯改性的环糊精固定相。

Armstroing[13-15]等合成出了一系列酰基和异氰酸酯改性的环糊精手性固定相。

环糊精键合相的衍生化，增大了固定相与溶质分子的疏水相互作用或π-π相互作用，扩大了手性拆分的范围和能力，在正相和反相条件下，都有很好的拆分能力，所以又称多模式手性固定相（multimodal csp,MMcsp）。

与纤维素和淀粉类涂覆型固定相不同，衍生化的环糊精是共价键合到硅胶上的，所以对温度和溶剂的限制较少。

（R,S）-萘乙基氨基甲酸酯β-CD 是最先使用的MMCSP。

Li和Purdy[16]合成了一系列苯基、萘基和吡啶基改性的β-CDMMCSP,Okamoto等[17]合成了3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯β-CD-MMCSP,。

这些固定相由于既具有环糊精疏水空腔的包合作用，又具有芳香环的π－π作用，氢键作用和立体排阻效应，所以又称为多作用手性固定相（Multiple－interraction chiral stationary phase）。

8.2环糊精键合固定相8.2.1键合方式环糊精最重要的特点是能与许多有机分子、离子、游离基、无机分子等形成包容配合物。

这些包容配合物不仅能以固体状态存在，而且在水和某些有机溶剂中也是稳定的。

在配合物中，环糊精被称为主体，进入空腔中的分子或离子被称为客体。

客体分子能进入环糊精空腔，主要是疏水亲脂作用，范德华作用，静电引力作用，释放出包容的高能水分子和体系张力能的作用，而客体分子与环糊精空腔的体积匹配作用是最重要的。

正是由于环糊精的这一特性和良好的手性识别能力，在液相色谱手性分离中常用作流动相添加剂和固定相。

其中，由于环糊精固定相操作简便而得到广泛应用。

前已提及，早期使用的环糊精固定相是通过聚合、交联生成的颗粒。

机械强度差，柱效低，不能进行高速高效分离，以后发展出的化合键合固定相克服了上述不足。

化学键合环糊精是利用环糊精分子中活性羟基，通过间隔垫分子把环糊精共价键合到硅胶表面。

从化学反应活性考虑，环糊精分子中3种－OH的反应活性顺序是C6-OH>C2-OH》C3-OH. C6-OH的化学反应活性最强，而C6-OH又在环糊精分子的小口一方，所以环糊精键合通常都是环糊精的小口边与硅胶上的间隔垫连接。

C 2与C3位羟基的活性也有明显的差别，C3位羟基的活性要比C2位低的多，由于互相处于邻位，影响C3位的取代反应不完全，但C3位羟基磺酰化之后，在碱性条件下也易与C2羟基生成2,3－脱水环糊精。

大体积的反应物优先靠近到C 6-OH，它最容易接近。

C2-OH的酸性最强，Pka＝12.2，在无水条件下易选择性的去质子，进而与亲电试剂反应。

C3-OH反应性最低，在C6，C2位羟基被封锁之后才能选择性的进行反应。

羟基可以直接与烷基卤化物、环氧化物、烷基或芳基酰卤、异氰酸酯以及无机酸的卤化物反应生成酯或醚。

环糊精与硅胶键合连接的方式可以有以下几种：1.胺键连接氨丙基键合相与硅胶反应：2.酰胺键连接羧酸化的氨丙基硅胶键合相与乙二胺基环糊精反应：3.碳氧碳键连接醚基硅胶键合相与环糊精反应：前两种键合方式在连接隔垫上含有氮原子，稳定性差，易水解，第三种不含氮的键合相已证明在标准高效液相色谱条件下，是相对稳定的〔〔[18,19,20]。

目前这类固定相已作为Cyclobond商品出售。

β-CD，γ-CD和α－CD键合相的商品名分别为CyclobondⅠ、Ⅱ、Ⅲ。

Cyclobond被认为是最成功的液相色谱固定相之一。

8.2.2β-环糊精键合相不含氮原子的醚键连接的β-环糊精键合固定相的制备方法有两种。

一种是先将含有环氧基连接体键合在硅胶基质上，而后与环糊精反应得到环糊精键合固定相[21]〔。

另一种合成方法[22]是先将连接体试剂与环糊精反应，再与硅胶反应得到环糊精键合固定相。

我们通过对两种制备方法比较的结果表明[23]，用第二种方法制备的β-CD固定相含碳量高，对评价样品O-,M-,P-硝基苯胺异构体分离度好，说明固定相上β-环糊精的键合量比第一种合成方法得到固定相高。

合成步骤下式所示：在合成的β-环糊精固定相上，对如图8.1所示的三种硫代缩水甘油醚和两种硒代缩水甘油醚进行了拆分。

图 8.1外消旋化合物结构影响手性分离的因素很多，在确定的固定相条件下，对确定的样品来说，流动相的组成是影响分离的关键因素。

流动相的组成对样品保留和拆分的影响参见表8.2。

可以看出，随着流动相中甲醇含量的增加，容量因子k减小除两个硒代缩水甘油醚外，分离因子α总的趋势也是减小的。

这是由于随着流动相这甲醇含量的增大，相对疏水的甲醇分子占据环糊精内腔的几率也会增加，样品芳香环进入内腔的几率减小，故保留值减小。

表8.2 流动相甲醇含量对k’和α的影响甲醇/ 40/60 45/55 50/50缓冲液*（v/v）k1’k2’αk1’k2’αk1’k2’α样品1 4.00 6.74 1.69 2.34 3.38 1.44 1.64 2.09 1.282 6.99 11.23 1.61 3.22 5.13 1.54 1.87 2.71 1.453 12.24 16.53 1.35 5.05 6.71 1.33 2.72 3.51 1.294 8.08 10.31 1.28 4.20 5.35 1.33 1.96 2.50 1.285 4.93 7.27 1.47 3.10 4.04 1.30 1.91 2.61 1.37缓冲液：0.3％醋酸三乙胺（PH5.0）在用环糊精手性键合相拆分对映异构体时，对样品的结构有特殊要求，一是样品分子必须部分能够进入环糊精内腔，二是样品分子手性中心上的极性基团与环糊精腔中的羟基发生缔合作用[23]。

所拆分的5种化合物都含有苯环或萘环，能与环糊精内腔发生包容络合作用。

尽管样品分子中手性中心上的羟基距芳香环较远，但通过合适的取向，仍能与环糊精腔口的羟基形成氢建，所以这几种化合物的对映体在环糊精键合固定相上能得到较好的分离[24]。

（见图8.2）。

图8.2缩水甘油醚对映体拆分图柱：150×4.6mm；固定相：β-环糊精键合相；流动相：甲醇/0.3％醋酸三乙酯（PH5.0）＝40/60（v/v）;流速：1.0ml/min.环糊精键合固定相有良好的化学和物理稳定性，是目前应用最广泛的手性固定相之一。

由于环糊精的内腔是疏水的，所以在反相分离模式条件下，疏水溶质占据环糊精的内腔并生成包合配合物是溶质保留和手性选择性分离的基础。

在正相条件下，疏水性的流动相占据了环糊精的内腔，溶质与环糊精内腔口羟基的相互作用是主要的。

因此，在正相条件下与二醇基柱类似[27]，手性选择性差。

为了扩大环糊精键合相的应用范围，出现了改性环糊精键合固定相。

通常有5种功能团可以连接在环糊精键合固定相上[25]：（1）乙酰基，（2）2－羟丙基，（3）萘乙基氨基甲酸酯，（4）二甲基丙基氨基甲酸酯，（5）对－甲苯甲酰酯。