引物设计、选择核酸内切酶、酶切位点之Primer5.0使用
下面以目的基因CD63 为例，介绍一下真核表达载体PcDNA3.1(+)-CD63的构建过程
1 cd63基因序列的获取
打开NCBI-选择
输入cd63 回车
找到第16条编码为 1 的打开后可见该积基因的详细信息，找到CDS（编码序列）
可见其编码序列为第146到862位碱基，继续往下拉，可见基因序列，选中编码序列（146-862）复制，打开Primer 5.0
（起始密码子）ATG gc ggtggaagga ggaatgaagt gtgtcaagtt
181 tttgctctac gttctcctgc tggccttctg cgcctgtgca gtgggattga tcgccattgg
241 tgtagcggtt caggttgtct tgaagcaggc cattacccat gagactactg ctggctcgct
301 gttgcctgtg gtcatcattg cagtgggtgc cttcctcttc ctggtggcct ttgtgggctg
361 ctgtggggcc tgcaaggaga actactgtct catgattaca tttgccatct tcctgtctct
421 tatcatgctt gtggaggtgg ctgtggccat tgctggctat gtgtttagag accaggtgaa
481 gtcagagttt aataaaagct tccagcagca gatgcagaat taccttaaag acaacaaaac
541 agccactatt ttggacaaat tgcagaaaga aaataactgc tgtggagctt ctaactacac
601 agactgggaa aacatccccg gcatggccaa ggacagagtc cccgattctt gctgcatcaa
661 cataactgtg ggctgtggga atgatttcaa ggaatccact atccataccc agggctgcgt
721 ggagactata gcaatatggc taaggaagaa catactgctg gtggctgcag cggccctggg
781 cattgctttt gtggaggtct tgggaattat cttctcctgc tgtctggtga agagtattcg
841 aagtggctat gaagtaatg t ag 其中 tag（（UAG）终止密码子，设计引物的时候需要将其删除，因为，真核表达载体上多含有标
签序列，目的基因与载体链接后，在目的基因的下游即为标签序列，如果不去除上述终止密码子，则目的基因转录的时候就会在此终止，标签序列就不会得到表达，为后续帅选阳性克隆等实验带来困难！
点击 file-new-DNA sequence-将编码序列复制（ctrl V）
选择 As is
2 限制性内切酶的选择
通过查看 PcDNA3.1（+）载体图谱，选择合适的内切酶，筛选的标准是，目的基因序列内不存在该酶的酶切位点，以及选择实验室内常用的已有的酶。
另外pcDNA3.1（+），和（-）的含义是都是多克隆载体，只是多克隆位点区有差异，应用都是一样的，都可以做真核表达
我们可知载体上存在这些酶切位点
结合本实验室拥有哪些常用的酶选择合适的两个酶
科技楼常用 BamH I、Xho I、Hind III、EcoR I、Pst I、Bgi II这几种酶，所以尽量选择这几种，以便省去买那些不常用的酶，造成浪费
下面看
点击 Enzyme，将刚才我们列出的几种酶从左面导入到右面，点击 OK
出现
Pst I这种酶在目的基因内部第 625个碱基出存在酶切位点，则该酶不能使用，我们可以从BamH I、Xho I、Hind III、EcoR I、Bgi II中选择两个，
两个酶切位
点之间相距不要太近，以免因为空间位阻影响酶的切割效率，上图左边为上游酶切位点，右面为下游酶切位点，上下游各选择一个，故我们可以选择Hind III 和Xho I、BamH I和Xho I、HindIII和XhoI 几种组合，又因为每种酶发挥效能时需要合适的液体环境，即Buffer，我们尽量选择两种酶都能正常使用的Buffer，见下表：
我们选择了Hind III和Xho I ，查表可知应选用 1×M Buffer
这样酶切位点和酶，buffer都选好了，下面开始设计引物
3 引物设计
点击 Primer-左上角file-preferences 可以选择引物的长度，一般是18-26个碱基，我们可以从18开始，逐渐试，以选出最优引物长度
S 代表上游引物，序列和目的基因5’端碱基序列一样，
图中显示对18个碱基的上虞噢引物的评价，里面有多个指标以评价引物质量，全是None的时候最好，如果不能满足，则至少要让False Primering这一项是None，如果都无法满足，则只能凑合用了，接下来可以设定19个、20个….碱基的长度，不一一列举了。
这样我们选择的上游引物长18bp，点击 Edit Primers，可以将引物序列复制出来5’ATGGCGGTGGAAGGAGGA-3’
设计下游引物，点击 A 将滚动条拖到最右端，设定长度，再选择，结合评价选择合适的下游引物我们选择 20bp，点击 Edit Primers，可以将引物序列复制出
来5-CATTACTTCATAGCCACTTC-3下游引物其实就是目的基因序列从3’端开始的20个碱基的反向互补序列（具体可以参照基因序列自己体会）
引入酶切位点和保护性碱基（酶作用时形成粘性末端，故需在酶切位点的5’端加上几个保护性碱基，以使酶正常发挥作用）
常见酶切位点和保护性碱基
则引入酶切位点后的引物序列为
上游引物
CD63-F 5’-CCC AAGCTT GCCACC ATGGCGGTGGAAGGAGGA-3
CCC为保护性碱基，蓝色字体为 Hind III酶切位点，在酶切位点后引入kozak 序列（kozak序列存在于真核生物mRNA的一段序列,其在翻译的起始中有重要作用。
核糖体能够识别mRNA上的这段序列,并把它作为翻译起始位点，GCCACC与后面ATG形成为kozak序列
下游引物
CD63-R ：5-CCG CTCGAG CATTACTTCATAGCCACTTC-3
这样我们就设计好了目的基因扩增所需的上下游引物以及为后续构建重组质粒所需的酶切位点。
下一步，PCR扩增目的基因，扩增体系，程序见前期发的心得，扩增产物经琼脂糖电泳分离，DNA胶回收试剂盒回收目的片段
分别对目的片段和pcDNA3.1 空载体行 Hind iii 、Xho I双酶切，琼脂糖电泳分离酶切后的片段，将双酶切后的载体和目的基因连接，连接产物转化 BL21，涂板，如图
pcDNA3.1 具有Amp+抗性，加入氨苄筛选阳性克隆，挑菌，扩大培养，抽提质粒，对质粒双酶切鉴定，以确定是否含有目的基因，如有，1ml 菌液送生物公司测序，如果测序结果和已知基因序列一致，则获得成功构建的重组真核表达载体 pcDNA3.1（+）-CD63
写完了，希望大家能看懂，并对当前试验有较深的理解，以及整个试验流程有个简单的认识，现在大家对所做的提质粒什么的不知道为何、有什么意义，这篇文章把我们当前所做的实验前后串了起来，可以使我们对实验有个清楚的认识，形成一条线。