香菇多糖提取工艺的研究1引言多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，广泛存在于动物、植物和微生物细胞壁中,是生物体内除核酸和蛋白质以外的又一类重要的生物分子,尤其是一类重要的信息分子[1]。
到目前为止，已有近300种的多糖化合物从天然产物中分离出来，其中植物提取水溶性多糖最为重要。
从植物中提取多糖主要根据不同溶解度来选择溶剂进行。
香菇多糖的提取一般有热水提取法、酸提取法、碱提取法、酶提取法和微波助提法等方法[2]，本文进行了浸提香菇多糖的工艺条件研究，以期获得香菇多糖的最佳提取条件，为其产业化生产提供有效的方法和技术参数。
本实验采用各种溶剂和酶的处理,提取香菇多糖,保持多糖的生物活性，效果是明显的。
1.1香菇多糖的组成与药理价值香菇多糖(LentinanLNT) 是一种β—1,3—葡聚糖，系从担子菌纲伞菌科真菌香菇子实体中提取分离纯化获得的均一组分的多糖。
多糖以甘露糖为主，含少量的葡萄糖、微量的岩藻糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等；肽链由天冬氨酸、组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酸等18种氨基酸组成。
LNT的化学结构是一种以β—D—[1~3]葡萄糖残基为主链，侧链为(1—6)葡萄糖残基的葡聚糖，平均分子量约为50万道尔顿[3]。
香菇多糖1969年在日本首先发现，自此，国内外学者对LNT作了许多深人的研究。
近年来，LNT广泛药理作用研究取得了很大进展。
主要的药理价值有：免疫调节作用；抗肿瘤作用[4]；抗病毒作用；对寄生虫、霉菌、细菌等感染均有治疗作用；有抗衰老、抗辐射作用，还具有预防实验性高脂血症和高血糖作用。
在临床上LNT还用于治疗小儿反复呼吸道感染，糖尿病，寻常型银屑病，硬皮病，面部扁平，尖锐湿疹等。
此外，硫酸化香菇多糖具有显著抗HIV作用，香菇多糖在治疗胃癌、结肠癌、肺癌等方面有良好疗效[5]。
作为免疫辅助药物，香菇多糖主要用来抑制肿瘤的发生、发展和转移，提高肿瘤对化疗药物的敏感性，改善患者的身体状况，延长其寿命。
香菇多糖有如此神奇的生物活性，科学家们已经开始在基因水平探讨香菇多糖生物活性的机制。
总之，香菇多糖具有广泛的药理作用，而且其疗效好，毒副作用小，是一种应用前景广阔的天然药物。
1.2 香菇多糖提取的现状分析目前国内对香菇多糖的提取分离有了很大发展，主要采用的方法有传统热水提取法、酸提取法、碱提取法，这些方法都有其优点，也有其难以克服的不足之处。
传统热水浸提方法存在能耗高，提取时间长的缺点，其工业化应用和发展受到限制。
酸碱处理香菇，反应条件剧烈，提取液又需经过中和反应，很可能破坏多糖的结构，会使香菇多糖的分子量降低，致使药用价值下降。
微波辅助提取法具有设备简单、快速、高效、安全等特点，可供选择的溶剂较多。
利用微波强化固液浸取过程是颇具发展潜力的一种新型辅助提取技术[6]。
微波(Microwave) 是频率介于300MHz 和300GHz 之间的电磁波，频率很高，能够透入物体的深处。
微波射线辐射于溶剂并透入细胞内部，可使溶剂及细胞液吸收微波能而温度升高，压力增大。
当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，细胞内容物释放出来，转移并溶解于溶剂中，提高了多糖提取率。
近年来生物酶广泛应用于各个领域，在国内也开始将其应用于中草药提取中。
多糖通常被包裹在植物细胞壁内，并且多糖往往和蛋白质结合在一起，以蛋白多糖的形式存在。
试验发现木瓜蛋白酶能有效酶解与多糖结合在一起的蛋白质，从而将多糖释放出来而提高多糖的得率，同时降低了多糖中蛋白质的含量，提高了多糖的纯度。
1.3 香菇多糖提取的研究意义多糖是近年来研究最为活跃的高分子化合物，真菌糖由于具有多种生物活性，其研究进展则尤为迅速。
目前，从各类生物材料中提取的具有生物活性的多糖已经成为天然药物的一个新来源。
香菇是一种食用和药用真菌，自古以来就被当作健脾益气、调和阴阳、补虚扶正、行气活血的上品。
其主要有效成分香菇多糖，经二十多年的研究和应用，证实其具有显著提高免疫力、抗癌、抗病毒、降血脂、防止动脉硬化、抗衰老等多种功能[7]。
此外，香菇多糖还具有诱发干扰素和保肝等作用。
因此，近年来在国内外形成了一股研发香菇多糖的热潮。
目前，国内的香菇多糖产品有两种，即“口服香菇多糖”和“肌肉注射香菇多糖”，国外的香菇多糖产品有“粉针静脉注射香菇多糖”，由日本独家生产。
由于香菇多糖是高分子化合物，分子量大，不易透过血管壁而被吸收，致使口服和肌肉注射的疗效远不如静脉注射。
为此，我国和世界其他国家均向日本进口该产品。
国内目前有数家单位在致力于静脉注射香菇多糖的开发，虽然现已取得较大进展，但是由于静脉注射香菇多糖要求的纯度高，一般实验室水平达不到要求，因此,研发高效、经济的香菇多糖的提取方法具有重要的现实意义。
1.4 香菇多糖的应用前景我国是食用菌生产大国, 其中香菇的产量在世界居首位[8]。
20 世纪70 年代以来, 食用菌多糖的研究开发进入了一个崭新的发展时期, 香菇多糖的研究已成为一个热点, 但目前主要集中在香菇中β-( 1→3) - D- 葡聚糖的研究上, 而其它多糖组分与生物活性之间的关系还有待进一步的明确。
香菇多糖不仅是一种比较理想的药物, 也是一类重要的保健食品功能因子, 具有广阔的应用前景, 是当今医药和食品工业共同关注的焦点。
但目前多糖的提取率普遍不高, 因此, 提高香菇多糖的提取率已成为进行多糖产品开发需要解决的关键问题, 不仅可以考虑将多种提取手段结合起来优化提取工艺, 还可以通过遗传育种、基因重组、物种诱变等手段选育出高产多糖的香菇菌株, 提高香菇中的多糖含量, 以提高香菇多糖的提取率, 降低生产成本。
2 实验仪器、材料及试剂2.1 主要实验仪器电热恒温水浴锅北京市长风仪器仪表公司低速自动平衡离心机上海安亭科学仪器厂电子天平（精确度为0.0001g）北京赛多利斯仪器系统有限公司SHD—Ⅲ型循环水式多用真空泵保定高新区阳光科教仪器厂电热恒温鼓风干燥箱上海博讯实业有限公司医疗设备厂SP-2100型分光光度计上海光谱仪器有限公司分析用研磨机德国IKAGalanz WD800B型微波炉佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司2.2 主要实验材料与试剂干香菇超市95%乙醇溶液分析纯氢氧化钠（NaOH）分析纯浓硫酸（H2SO4）分析纯葡萄糖（C6H12O6）分析纯盐酸（HCl）分析纯氯仿(CHCl3) 分析纯苯酚分析纯正丁醇分析纯活性炭分析纯木瓜蛋白酶酶活力》50万单位3 工艺流程及测定方法3.1 工艺流程3.1.1微波辅助工艺方法原料烘干粉碎称重热水抽提微波辐射香菇多糖干燥sevag法脱蛋白醇析、复溶滤液脱色抽滤3.1.2 采用酶解工艺的改进方法原料烘干粉碎称重酶水解活性炭脱色灭酶香菇多糖干燥浓缩复溶滤液醇析抽滤3.2 多糖的提取方法将干香菇后粉碎，准确称取2克香菇粉加入一定比例的蒸馏水，在一定温度下浸提数小时，用真空泵减压抽滤，将滤液加入乙醇进行沉淀，离心得沉淀物，将沉淀物溶解后脱蛋白，定容，测吸光度值，然后将溶液浓缩，加入一定体积乙醇进行沉淀，离心，烘干，得到香菇多糖粗品。
3.2.1 除蛋白的方法的选择香菇中除含大量的多糖外，还含有一定量的蛋白质和其他杂质。
目前用于多糖除蛋白的方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法及三氯乙酸法（TCA），其中前两种方法用于微生物多糖，后一种方法用于植物多糖。
另外TCA法与Sevag法比较具有蛋白质去除效果高、多糖损失率低、可同时除去大量色素等优点，所以本研究采用Sevag法除蛋白，即将离心分离得到的粗多糖沉淀溶于适量蒸馏水中，加入20%体积的氯仿和7%体积的正丁醇生成絮状凝聚物，3500r/min离心15min除去沉淀。
重复上述操作，直至无凝聚物生成。
3.2.2 香菇多糖的脱色及测定方法活性炭为黑色颗粒, 无臭、无味，具有无毒和脱色、脱臭效果良好的特点, 可以反复使用, 成本低, 适合工业化生产的需要。
颗粒活性炭具有惊人的比表面积(800～2000m2/g)[9], 当被脱除的有色物质的分子直径小于或等于活性炭孔的入口直径时, 可被活性炭吸附而起到脱色的效果[10]。
活性炭的脱色效率高、速度快、成本较低, 但也存在一些问题, 如再生困难、多肽和氨基酸损失率较高。
吸附剂是酶解液脱色的主要影响因素，从液体中脱除颗粒活性炭较容易，所以选择颗粒活性炭并优化其脱色工艺。
用SP-2100分光光度计在色素的最大吸收波长处测其吸光度值[11]。
分析表明: 香菇多糖酶解液的吸收峰在350-380nm之间, 最大吸收峰360nm, 故选360nm为测定波长。
酶解液原色为棕黄色或褐色, 测其在360nm处的吸光度值1.987[12], 记脱色前OD360nm=1.987。
脱色率(%)=(1.987- OD360nm)/1.987×1003.3 香菇多糖测定方法3.3.1 香菇多糖提取率的测定方法本实验采用苯酚硫酸法测定香菇多糖提取率[13]，并在需要的部分做恒重实验，具体做法如下：称取烘干的香菇粉2克，加水于一定温度下提取若干时间，冷却后减压抽滤，取滤液，加无水乙醇沉降，脱蛋白，然后再次离心分离即为粗多糖，在水中溶解一定倍数后测吸光度查标准葡萄糖曲线即得得率。
恒重法是指[14]，经过提取、醇沉、脱蛋白和离心得粗多糖后，将其洗入蒸发皿中，放入电热恒温鼓风干燥箱中，60℃烘干至恒重，并粗算得率。
3.3.2 标准葡萄糖曲线的绘制采用苯酚-硫酸比色法，以葡萄糖为标准品。
准确移取0.6000 mg/ml 的葡萄糖标准溶液1.5ml、2.5 ml、3.5 ml、4.5 ml、5.5 ml，分别转移到50 ml容量瓶中定容、摇匀得系列对照品溶液。
准确移取上述葡萄糖标准溶液2.0 ml置于25ml具塞试管中，加入4.0%苯酚溶液1.0 ml，浓硫酸4.0 ml 摇匀，沸水浴保温15 min 后放入冷水中冷却。
以试剂空白为参比，选用1cm 比色皿在最大吸收波长490 nm 处测定其吸光度[15]，得标准曲线。
图 1 苯酚-硫酸法的葡萄糖标准曲线用最小二乘法进行回归，得标准曲线方程为：A=0.0076x+0.0105，线性相关系数R=0.9972。
3.3.3 提取率的测定量取纯化后的定量样品，加无水乙醇离心分离，取沉淀，加蒸馏水溶解后转移至50 ml 容量瓶中定容,再称取1 ml 转移至另一个50 ml 容量瓶中定容。
准确移取2.0 ml 于25ml 具塞试管中后按上述方法操作，并根据标准曲线计算多糖提取率。
3.3.4 多糖提取率的计算多糖提取率(%)＝待测物克数多糖克数×100% ＝6102500⨯⨯待测物克数曲线中所查多糖微克数×0.9×100%4 实验方法4.1 微波辅助热水浸提法的单因素实验称取香菇干粉移入锥形瓶中按一定料液比加水搅匀，在设定温度的水浴锅中恒温浸提设定时间，转入微波专用杯在额定功率一定的微波炉中处理一定时间，将处理液抽滤，滤液浓缩至一定体积，加3倍体积的95%乙醇醇析[16]，待产生的沉淀物沉淀30min后再离心，将沉淀进行溶解测定，测定完后将其粗多糖干燥至恒重。