非那西丁的药代动力学研究实验报告一.概述：非那西丁(Phenacetin)为一种解热镇痛药，因为潜在副作用在临床已基本不使用。

但由于其是CYP1A2酶的特异性底物，被广泛选择作为底物用于酶活性测定实验以及影响酶活性作用药物的研究。

本学期临床药代动学实验课以非那西丁在大鼠体内的代谢实验、大鼠肝微粒体温孵实验两部分为例，通过实验设计，实验操作，结果评价等一系列过程，系统地学习了药代动力学中药物体内外的简单研究方法、实验数据的处理、以及相关药动学参数的计算与评价。

二.正文1.非那西丁在大鼠体内的药代动力学研究1.1实验目的研究非那西丁在大鼠体内代谢的药代动力学，学习大鼠眼底静脉丛取血等操作。

1.2实验材料与方法仪器：HPLC-UV色谱仪，高速冷冻离心机，涡旋振荡器；HPLC色谱条件：检测波长：254nm色谱柱：inertsil-ODS-SP,5um,4.6*150mm流速：1.0ml/min柱温：40℃流动相：40(乙腈)：60（50mM磷酸盐缓冲液）（注：50mM磷酸盐缓冲液配制：6.8g磷酸二氢钾，加入150ml氢氧化钠溶液（0.1M），配制成1L的磷酸盐缓冲液）试剂：非那西丁注射剂，对乙酰氨基酚标准品，肝素钠，10%高氯酸；实验动物：雄性大鼠，180g—220g1.3实验步骤1.3.1标准曲线的制备：取空白血浆，加入对乙酰氨基酚标准品，使其浓度分别为0.156,0.313,0.625,1.25,2.50,5.00,10.00ug/ml。

在给定的色谱条件下进行HPLC分析，以样品的峰面积对样品浓度进行线性回归。

1.3.2给药及血浆采集处理：取大鼠一只，尾静脉注射非那西丁（10mg/kg）后，分别于0，5,10,15,30,45,60,90,120min于尾静脉取血0.5ml ，肝素抗凝。

离心取200ul 血浆。

向血浆中加入100ul 10%高氯酸，涡旋振荡1min （转速为15000转/分钟），离心10min ，取上清供HPLC 分析。

1.4实验结果处理表1 体内实验中对乙酰氨基酚标准曲线组别 浓度（ug/ml) 峰面积 理论峰面积 准确度 1 0.156 14359 19283 (0.2554)2 0.312 543903 0.625 33219 36462 (0.0889)4 1.25 65033 59355 0.0957 5 2.50 106799 105142 0.01586 5.00 200067 196714 0.0170 710.00377336379859(0.0066)舍去第2组数据做图得对乙酰氨基酚的标准曲线（图1），用标准曲线的回归方程带入浓度计算标准曲线准确度（表1），可见除第1、2组数据外其他点基本符合 准确度<20% 这一条件（考虑到样品定量范围且第一组数据准确度基本接近20%，第1组数据不舍去），说明标准曲线有效，可用来计算定量样品。

图1 体内实验对乙酰氨基酚标准曲线050000100000150000200000250000300000350000400000024681012C(ug/ml)A以得到的标准曲线的回归方程计算以10mg/kg 给药的大鼠血浆样本中的非那西丁的浓度得表2 大鼠血浆样本中非那西丁的浓度组别 取血时间/min 峰面积 （ug/ml)1 6.5 50464 1.0072 10.5 49283 0.975 3 14.5 42107 0.7794 29.5 35993 0.612 54513359-0.006注：第5组数据是有问题的，有可能与大鼠的死亡前代谢状态改变有关系，故后续处理舍去第5组数据。

静脉注射后非那西丁在大鼠体内的代谢符合一房室模型，以一房室模型拟合得图2 非那西丁c-t一房室拟合0.20.40.60.811.21.40510152025303540t/minc /(u g /m l )根据拟合方程计算非那西丁的药动学参数，得 c 0 =1.1621ug/mlVd=x 0/ c 0=10(mg/kg)/1.1621(ug/ml)=8.60L/kg t 1/2=0.693/k=0.693/0.0223=31.08minCL=kVd=0.0223*8.60L/kg=0.192L/(min ·kg)AUC= x 0/(kVd)=10(mg/kg)/0.192L/(min ·kg)=52.08mg/L ·min 1.5讨论1）标准曲线组数据为其他实验组同学数据，本组由于HPLC 测定时仪器出倒峰，未取得实验数据。

2）取血点的设定：取血点应覆盖药物的吸收相、平衡相和消除相，一般设计在吸收相和平衡相各2-3个点，消除相内4-5个点。

整个采样时间至少应为3-5个半衰期，或采样持续至峰浓度的1/10-1/20。

查文献得非那西丁静注后在大鼠体内的半衰期一般为0.5h左右，故整个取血时间持续 1.5-2.5h时较为合理。

3）色谱条件的设定：色谱条件的选择首先应保证测定物质能够良好的分离，同时还应该考虑方法的可行性，需要的操作时间等因素。

4）取血操作：应在取血前向EP管中加入适量肝素溶液，取入血液后立即上下翻动2-3次使肝素与血液混合防止血液凝固，但不可用力过猛以免溶血影响后续测定。

5）数据分析：本组实验中，由于大鼠死亡，取得血浆样本的时间点较少，故拟合曲线的偏差也比较大。

因此虽然最后由此求得的t1/2处于一般范围内，但因为数据较少，且为单只动物实验，不排除结果的偶然性。

2.大鼠肝微粒体温孵实验2.1实验目的了解肝微粒体及肝微粒体酶活性的评价方法,学习肝微粒体温孵液中对乙酰氨基酚浓度测定方法的建立。

2.2实验材料与方法仪器：HPLC-UV色谱仪（色谱条件同前）、高速冷冻离心机、涡旋振荡器、恒温水浴锅；试剂：大鼠肝微粒蛋白溶液、NADPH再生系统（0.5mM·NADP+、5mM·MgCl、10mM·G-6-P、1U·G-6-P脱氢酶）、对乙酰氨基酚、非那西丁、冰甲醇2.3实验步骤2.3.1.标准曲线的配制：180ul大鼠空白肝微粒体，加入20ul不同浓度的对乙酰氨基酚，配成对乙酰氨基酚浓度分别为1.56、3.12、6.25、12.5、25、50、100uM的一系列溶液，再加入100ul冰甲醇沉淀，涡旋2min,12000rpm,离心10min,取上清，20ul进样分析。

2.3.2.温孵实验及样品处理：80ul大鼠肝微粒体溶液，分别加入80ul浓度依次为6.25、12.5、25、50、100、200、400uM的非那西丁探针底物，37°C预温孵5min后，再分别加入NADPH溶液40ul，于37°C温孵30min。

加入100ul冰甲醇沉淀，涡旋2min,12000rpm,离心10min,取上层有机相200ul，20ul进样分析2.4实验结果：表3 温孵实验中对乙酰氨基酚标准曲线组别浓度（umol/l) 峰面积理论峰面积准确度1 1.56 3669 4332 (0.1531)2 3.12 6133 7731 (0.2067)3 6.25 14488 14552 (0.0044)4 12.5 28850 28170 0.02415 25 58782 55408 0.06096 50 108154 109883 (0.0157)7 100 139879第7组数据偏差较大，舍去第7组数据后作图得标准曲线（图3），用标准曲线的回归方程带入浓度计算标准曲线准确度（表3），第2组数据准确度>20% ,但舍去第2组数据后，得到的标准曲线虽然R2稍有提高(R2=0.998)，但再次代入计算准确度时另几组值准确度均有偏大倾向，且考虑到数据组数减少时误差组数据。

变大，故保留第2表4 温孵实验中相关数值计算组别峰面积c-PARA（umol/l)c-PHE(umol/L)1/c-PHEv-(umol/h/g.protein)1/v1 2591 1.1743 6.25 0.16 11.7426 0.08522 9340 4.2329 12.5 0.08 42.3295 0.02363 6035 2.7351 25 0.04 27.3510 0.03664 16225 7.3533 50 0.02 73.5327 0.01365 27474 12.4514 100 0.01 124.5139 0.00806 34462 15.6184 200 0.005 156.1840 0.00647 43747 19.8264 400 0.0025 198.2642 0.0050第1组数据不在标准曲线定量范围内，第 3 组数据偏差过大，故舍去第1、3组数据，剩下5组数据以双倒数法作图。

由图4：km/vmax =0.2289 1/vmax =0.006 进而，vmax=166.67umol/h/g km=38.15umol/L求得的vmax 为166.67 umol/h/g ，但显然测得的实测数据中的v 最大值大于此值，以底物浓度对反应速率作图（图5），也可看出曲线在最后一个点时仍呈上升趋势，也就是说在曲线范围内并未达vmax,结果存在偏差。

继续舍去表4中第2组数据进行双倒数回归，图6 双倒数法作图（2）0.00000.00200.00400.00600.00800.01000.01200.01400.016000.0050.010.0150.020.0251/c-PHE1/v由图6：km/vmax =0.4832 1/vmax =0.0037进而，vmax=270.27umol/h/g km=130.59umol/L该条件下求得的vmax 虽然不在标准曲线定量范围内，但比较符合图5中的反应趋势，更接近反应的真实状态。

2.5讨论：1）终止试剂的选择：酶反应实验中，终止试剂的选择非常重要，该类型实验中一般可选的终止试剂有乙腈和冰甲醇等，有实验表明乙腈终止时易产生干扰，故本实验选择了冰甲醇作为终止剂。

2）数据分析：根据温孵实验结果的结果分析，实验中反应并未达到最大反应速率。

一般在酶促反应中，反应的速率取决于底物浓度、反应时间、酶活性等因素，本次实验中在实验条件下未达到vmax,可能是由于此次所用的肝微粒体酶活性活性较高，在所设定的底物浓度范围内酶仍未达到饱和，可以通过减少肝微粒体酶的使用量，或者扩大底物浓度的设定范围来进行改善实验，使实验结果更具有科学性。

三.个人总结相较于往常的按照既定实验步骤操作的实验，本学期的实验需要实验者更加注重细节与思考，探索实验中每一项设定的原因、合理性、以及不同的条件设定对实验结果的影响，在此基础下，进行实验、处理结果时又更容易促发对实验原理和过程的反思，从而对整个实验以及药代动实验的设计有了一个比较深的认识。