► 重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键技术是补料策略， 限制性基质（葡萄糖）的流加模式有3种：恒速流加补 料、变速流加补料和指数流加补料。
2、基因工程菌培养方式
基因工程菌发酵的基本操作方式有：
分批培养 分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体密度也有限
半连续培养（补料分批） 在一次投料发酵的基础上，流加一定量的营养，使细胞进一步的 生长，或得到更多的代谢产物
2、基因工程菌培养过程的动力学模型 目前的研究多分散于培养过程的各个方面。 （1）外源基因的表达和控制机制 （2）质粒的行为规律 （3）外界环境对工程菌生长及产物表达的综合影响
多采用二阶段培养 两种调节方式： •添加诱导物 •改变温度
（二）、基因工程菌发酵的设备
应用发酵罐来大规模培养基因工程菌。为了防止工程菌丢失携带的 质粒，保持基因工程菌的遗传特性，因而对发酵罐的要求十分严格。由于 生化工程学和计算机的发展，新型自动化发酵罐完全能满足这些要求。
基因工程菌的培养设备
发酵罐的组成部分有：
发酵罐体 保证高传质作用的搅拌器、 精细的温度控制和灭菌系统、 空气无菌过滤装置 残留气体处理装置 参数测量与控制系统（如 pH、O2、CO2 等） 培养液配制及连续操作装置等。
基因工程菌的培养设备
基因工程菌在发酵培养过程中要求 环境条件恒定，不影响其遗传特性，更不能引起所带质粒丢失。
► 优化细胞生长速率，使得碳源能被充分利用和 获得较高的产率，用养分流加来限制菌的生长 速率还能控制培养物对氧的需求和产热速率。
► 可用碳源作为限制性养分，且采用补料分批发 酵来实现高密度发酵。
高密度发酵技术
► 用于高密度发酵的生物反应器类型： 搅拌罐，透析膜反应器， 气升式反应器，气旋式反应器
► 在工业化生产中，通常采用的是搅拌罐与补料工艺来 进行高细胞密度发酵。
毕氏酵 母
酿酒酵 母
特征
需氧、 葡萄糖 过量、 形成乙
醇 嗜温菌
嗜温菌
嗜温菌
基础培养 基
葡萄糖矿 物盐或甘 油矿物盐
含葡萄糖 的完全培
养基
葡萄糖矿 物盐
含葡萄糖 的完全培
养基
发酵 罐类 型
搅拌 罐
培养方法 细胞干 培养时 重（g/L） 间（h）
葡萄糖 （甘油） 非限制指 数补料
140～ 150
30～40
对发酵罐有特殊要求 如要提供菌体生长的最适条件 培养过程不得污染 保证纯菌培养 培养及消毒过程中不得游离出异物，干扰细菌代谢活动
对发酵罐有特殊要求（续）
发酵罐的结构材料的稳定性要好，一般要应用不锈钢制成 罐体表面光滑易清洗，灭菌时没有死角 所有的连接接口均要用密封圈封闭，不得有泄漏 搅拌器转速和通气应适当 空气过滤系统要采用活性碳和玻璃纤维棉材料 培养液要经化学处理或热处理后才可排放 发酵罐的排气口须有蒸汽灭菌或微孔滤器除菌后才将废气放出。
非结构模型
最理想的情况是 Ⅰ 把细胞群体处理
为一种溶质
非离散模型 均衡生长（假设）
结构模型
细胞之间无差异， 细胞内部有多个 Ⅲ 组分（结构）
“平均细胞”各种 Ⅱ 细胞不均一
均衡生长（假设） 离散模型
实际情况是细胞之
间不均一细胞内部
多个组分
Ⅳ
图：对细胞群体生长的发酵动力学模型描述
常规的微生物发酵设备可直接用于基因工程菌的培养。不同点在于， 微生物发酵主要收获的是它们的初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要 目标。
基因工程菌培养是为了获得最大量的基因表达产物。由于这类物质是 相对独立于细胞染色体之外的重组质粒上的外源基因所合成的、细胞并不 需要的蛋白质，因此，培养设备以及设备控制应满足获得高浓度的受体细 胞和高量的基因表达产物。
搅拌 补料分批 185 罐 培养，以
葡萄糖调 节pH
搅拌 补料分批 100 罐 培养，补
甲醇
搅拌 连续培养， 210 罐 流加葡萄
糖
30 50～120
80
产率 (g/L)/d 90～100
160
120～ 150
50～150
高密度发酵策略
► 使用最低合成培养基以便进行准确的培养基设 计和计算生长得率。
一、基因工程菌发酵动力学 基因工程菌发酵控制的关键： •宿主的胜利遗传特性影响外源基因的表达 •外源基因的表达影响宿主的生长特性 （一）、基因工程菌的发酵动力学模型
基因工程培养体系是一个多相、多组分、非线性的 复杂系统。 1、基因工程菌的发酵动力学模型分类 对细胞群体的简化，假设有两个方面： •是否考虑细胞内部复杂的结构 •是否考虑细胞之间的差别
第十章 基因工程菌发酵
内容提要
•基因工程菌发酵动力学 •基因工程菌发酵设备 •基因工程菌的高密度发酵及控制 •基因工程菌发酵的后处理技术 •基因工程菌的不稳定性及对策 •基因工程生产干扰素
基因工程菌发酵的研究内容主要包括：
•基因工程菌的发酵动力学 •发酵工艺 •基因工程菌的稳定性 •基因工程菌发酵后处理 •产品的分离纯化
连续培养
连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程 度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。
连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研 究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等 创造了良好的条件。
但是由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一问 题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。 在这样的系统中关键的控制参数是诱导水平、稀释率和细胞比生长速率。优 化这三个参数以保证在第一阶段培养时质粒稳定，菌体进入第二阶段后可获 得最高表达水平或最大产率。
连续培养 不断地流加营养，并不断地取出发酵液。 连续培养则多用于动力学特性和稳定性等研究。
透析培养 固定化培养
补料分批培养
补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间， 间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。
在分批培养中，为保持基因工程菌生长所需的良好微环境，延长其生 长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来， 根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。
（三）、基因工程菌的高密度发酵及控制 1、高密度发酵 •代谢产物的合成是靠菌体作为生产者来完成的。 •高细胞密度发酵就是为了适应这一要求而得到 广泛的重视。 •高密度发酵：在发酵过程中保持较高的细胞密 度，同时细胞或菌体的生产能力保持在较佳的状 态。
高细胞密度发酵成功的实例
菌种
大肠杆 菌
枯草杆 菌