6000 r／min离心30s。倒掉废液收集管中的废液。 （7)加入750此漂洗液于离心吸附柱中，静置1 min后，6000r／min离心30s。倒掉废液收集管 中的废液。重复一次。倒掉废液后。再次于6000 r／min离心2min，尽量除去漂洗缓冲液。 (8)小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的 1．5 mLEppendorf离心管中，加入适量洗脱缓 冲液，常规50此，室温放置2．5min后，6000 r ／min离心2min。 (9)取5“L酶切后电泳鉴定。
优选
9
（一）、质粒DNA的提取
(1)接重组大肠杆菌一环于LB培养基中，振荡培 养过夜。
(2)取1．5mL菌液于Eppendorf管中，6000r／ min离心5 min。 (3)弃去上清，加入溶液I 100“L重悬菌体。 (4)加入溶液II 150“L，轻柔混匀。 (5)加入溶液III 150此，倒转混匀，8000 r／min， 离心10min。 (6)将420¨L结合缓冲液加入离心吸附柱中，然 后将步骤5中的上清加入优选离心吸附柱中混匀， 10
在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒
pEtac．dhaB．tac-yqhD和pUC．tac-dhaT，
研究为提高1，3．丙二醇产量提供了新途
径。
优选
5
1，3-丙二醇基因工程菌构建的路线
(1)串联表达来源于克雷伯氏菌(Klebsiella)编码油脱 水酶的基因dhaB以及来源于大肠杆菌(编码1，3 一丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD，构建
1，3-丙二醇新型基因工程菌的构建
生物技术1101班
李娟
优选
1
1，3．丙二醇简介
1，3．丙二醇是目前国际上公认的六大 石化新产品之一，其主要功能是作为合成 聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体。1，3一丙 二醇的生产方法有化学合成法和微生物转
化法，但从自然界中筛选的微生物厌氧发 酵甘油生产l，3一丙二醇还存在产物生产 周期长和转化率低等问题，目前仅有化学
优选
7
一、大肠杆菌JMl09的构建及其表达
优选
8
材料
1，菌株、质粒及基因片断：
大肠杆菌JMl09，质粒pUCl9，pEtac由 本实保藏；yqhD和dhaB基因分别从大肠
杆菌和克雷伯氏菌中克隆得到。
2，主要试剂：
质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒化
试剂盒 ；工具酶、抗生素 ；丙烯酰胺、甲
叉双丙烯酰胺、
合成法应用于工业生产。因此，利用基因
工程技术构建高产菌株备被认为是今后的
发展方向。
优选
2
1，3-丙二醇性质
• 物理性质：1，3．丙二醇(1，3-propanediol，l， 3-PD)是一种无色无味透明的液体，易溶于水、 乙醇、醚类和甲酰胺，微溶于氯仿和苯【3j，相 对密度为1．053 g／cm3，熔点．27℃，沸点 211℃，自燃温度为400℃。
(3)在摇瓶水平，对已构建优的选 产1，3．丙二醇重组菌6
1，3．丙二醇生物合成途径
l，3一丙二醇是一种典型的甘油发酵产物,并 未发现其可由其他有机底物厌氧转化而来。甘 油作为唯一碳源和能源，它可以沿着氧化和还 原途径发生歧化反应，氧化途径中产物与糖类 发酵产物一致，并产牛供细胞牛长所必需的 ATP，在某些产物形成的同时释放还原力NADH； 还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生 成1，3一丙二醇 。
轻轻吹吸悬浮菌体，冰水中放置30min。 （6)重复步骤(5)两次。
(7)8000r／min离心5min，然后静置2min， 冰水中迅速弃上清，加入预冷的CaCl280uL。 也可加40 uL50％的甘油保存代用。
优选
13
（三）、转化大肠杆菌
(1)取出感受态细胞，在冰水中融化。 (2)加入待转化的DNA，用吸头轻柔混合，不可 用漩涡混合仪。 (3)冰水浴40min。 (4)42℃热激90s。 (5)加入1mL LB培养基，37℃震荡培养1．2 h。 (6)涂布含有相应抗生素的LB平板。
优选
4
1，3-丙二醇基因工程菌构建的预期目标
• 本研究首先利用PCR方法从大肠杆菌中克
隆1．16 kb的1，3．丙二醇氧化还原酶同
工酶的编码基因yqhD2．80kb来源于克雷
伯氏杆菌甘油脱水酶的编码基因dhaB构建
了重组菌 i JM109(pEtac—dhaB—tac-
yqhD) 构建重组载体pUC．tac．dhaT，并
重组菌E coliJMl09(pEtac．dhaB．tac-yqhD);考 察其转化甘油的能力。
(2)利用PCR扩增来源于克雷伯氏茵的1，3一丙二醇 氧化还原酶dhaT，构建重组载体pUC．tac一砌口 T，并在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒pEtac— dhaB—tac-yqhD和pUC—tac-dhaT。
优选
14
（四）、大肠杆菌JMl09基因工程菌的构建
首先将来源于大肠杆菌的基因片段yqhD 连入载体pEtac上，得到重组质粒pEtacyqhD，经酶切，得到片段tac-yqhD连入载体 pUCl9，得到重组质粒pUC．tac-yqhD，将 来源于克雷伯氏菌的基因片段dhaB连入载体 pUC．tac-yqhD，以得到的重组质粒 pUC．dhaB．tac-yqhD。将重组表达载体酶 切连接到pEtac上，得到双启动子重组表达大 肠杆菌JM 109(pEtac优—选 dhaB-tac-yqhD)。 15
• 化学性质：高温下与羧酸缩合成酯，与异氰酸盐
及酸性氯化物生成聚氨酯。1。3一丙二醇最重
要的性质就是与二酸反应生成聚酯和聚氨酯。
优选
3
1，3-丙二醇用途
• 可直接用于防冻剂，是多种增塑剂、洗涤剂、防 腐剂和乳化剂的合成原料；也广泛应用于食品、 化妆品和制药等行业14j。
• 1，3．丙二醇最主要的用途是合成新型聚酯PTT 的原料。PTT纤维克服了PET纤从而引起纤维材 料界的瞩目，可用于生产地毯、短丝及长丝产品， 产薄膜、非织造布和单丝，用作热塑性工程塑料
优选
11
(二)、大肠杆菌感受态细胞的制备
(1)接种EcoliJM109于LB培养基中振荡培养过 夜。 (2)取0．5mL培养液于50mLLB培养基中37℃ 振荡培养至OD值O．3—0．4。 (3)菌液三角瓶放入冰水中，轻轻摇晃，使菌 液迅速冷却约10分钟。 (4)分装菌液到Eppendorf管(1．5mL)中， Eppendorf管迅速放入冰水中静置15min。 (5)8000r／min离心5min，然后静置2min，冰 水中迅速弃上清，加入优选预冷的CaCl2400uL，12