High Mobility Group Box-1 Protein
Tethered particle motion
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背景知识
V(D)J Recombination
V(D)J重组
V（D）J代表可变区V，多样区D，连接区J。重组是在T和B细胞成熟的早期阶段 仅发生在淋巴细胞中的基因重组的独特机制。它是B和T细胞上发现的免疫球蛋 白（Ig）和T细胞受体（TCR）的高度多样性的组成部分。 V（D）J重组负责组装在B和T淋巴细胞发育期间抗原受体的可变区。 在V（D）J 重组期间，同时位于特定染色体上的V，D和J片段被重排到功能性V（D）J或者 有特异性决定簇的B细胞受体或免疫球蛋白（Ig）和 T细胞受体（TCR）VJ等位 基因中。 与V，D和J基因区段相邻的是由高度保守的七聚体（共有序列5‘CACAGTG-3’）和九聚体（共有序列5‘-ACAAAAACC-3’）组成的重组信号序列 （RSS），被相对不保守的间隔序列12bp 或23bp（分别称为12RSS和23RSS）分 开。
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背景知识
Recombination activating gene
RAG
重组激活基因（RAG）是在编码免疫球蛋白和T细胞受体分子的基因 的重排和重组中起重要作用的酶。它有两种称为RAG-1和RAG-2的重组激 活基因产物，其细胞表达在其发育阶段限于淋巴细胞。RAG-1和RAG-2对 于产生成熟B和T淋巴细胞是两种细胞类型是必需的。 RAG蛋白启动V（D）J重组，这是pre-B和pre-T细胞的成熟所必需的。 研究表明RAG-1和RAG-2必须以协同方式工作以激活VDJ重组。当分离和 转染成纤维细胞样品时，显示RAG-1低效诱导VDJ基因的重组活性。当 RAG-1与RAG-2共转染时，重组频率增加了1000倍，这一发现促进了新修 订的理论，RAG基因不仅可以帮助VDJ重组，而是直接诱导VDJ基因的重 组。
In the presence of 5 nM RAG1/2c and 80 nM HMGB1 for 1 h。
结果
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Results
C
(i) paired complex formation and excision of the looped DNA faster than we can resolve with our method (ii) a pathway for cutting that does not require the two RSS sites to synapse
讨论
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Discussion
我们发现HMGB1增加RAG-RSS复合物中DNA长度的减少量。 这种 观察结果与在12RSS-RAG-HMGB1或23RSS-RAG-HMGB1复合物中检测 到的大弯曲的HMGB1依赖性一致，尽管那些研究使用短的寡核苷酸底 物。 我们还使用这种DNA链系长度的减少量来确定在RAG1 / 2c和 HMGB1存在下12RSS和23RSS的Kd，并且发现HMGB1与单独的RAG1 / 2c相比降低了两个Kd值，并且它们是相似的，与前面的观察一致。我们 研究HMGB1依赖过程的单分子实验可以扩展到研究除RAG1 / 2c以外的 其它可以与DNA结合并且可以被HMGB1促进的蛋白质（例如，肿瘤抑 制蛋白p53）。
讨论
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Thank You
其中B box是发挥炎症的功能区域，A box是B box的拮抗位点。A box和B box都能够与DNA结合， 并参与DNA双链的折叠与扭曲。
HMGB1
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背景知识
Tethered particle motion
TPM
Tethered particle motion (TPM)是用生物物理方法研究各种聚合物如DNA及其与其他物质（ 例如蛋白质）的相互作用。
讨论
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Discussion
在我们实验中使用的RAG1 / 2c和HMGB1的浓度下，在HMGB1存在 （或不存在）下与RAG1 / 2c相关的结合事件相对频繁，但是该结合 （配对复合物形成）的下游产物相对稀少 ; 在我们的实验中，珠子结合 到DNA上在配对的复合物状态中仅花费总观察时间的4％。 我们直接观 察到在DNA底物上存在12RSS和23RSS时配对复合物的形成。 当仅存在 12RSS（或不存在RSS）时，我们没有看到复合物形成的证据，并且我 们确认当使用1,200和1,800-bp间距时配对复合物时的表观长度与已经被 缩短了12/23的信号间距的系链一致。我们无法确定是否一个或两个 RSSs在配对的复杂形成之前被占领， 我们需要进行更多的研究来解决 这个重要机制问题。
实时检测单个RAG-RSS复合物。
结合动力学显示RAG-RSS复合物的平均停留时间。
HMGB1改变RAG-RSS复合物的结合性质。
直接观察平行复合物形成。
12/23规则调节珠释放作为RAG1 / 2c和HMGB1的函数的动力学。
讨论
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Discussion
我们观察到在没有HMGB1的情况下通过RAG的RSS结合的DNA长度 的明显减少，这与先前的工作一致，显示单独的RAG蛋白在RSS处弯曲 DNA。这种计算提供了RAG-RSS交互的Kd。我们期望，我们的单分子方 法可用于测量非共有RSS的Kd值，从而提供对RSS和RAG活性之间的关 系的更完整的理解。 该方法还允许首先测定RAG1 / 2c复合物结合到12RSS或23RSS的平 均停留时间。 我们发现RAG1 / 2c-RSS复合物是相当稳定的，停留时间在 几分钟的量级。 特别地是，我们发现，与23RSS（〜230s）相比，复合 物在12RSS（〜430s）处保持更长的结合时间，与两个位点之间的Kd的 差异一致;
5 nM RAG1/2c-----the red line is the rms trajectory of the bead and the black dashed line is the resulting segmentation between long and short states of the DNA tether.
结果
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fig.7
Dynamics of 12/23 Rule-Regulated Bead Release as a Function of RAG1/2c and HMGB1.
Results
结果
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Results
结果
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fig.8
Results
结果
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Discussion
结果
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fig.6
2900bp
Results
Direct Observation of Paired Complex Formation.
Display distinctly different DNA lengths of 1,360 bp for the 1,200bp intersignal substrate and 880 bp for the 1,800-bp intersignal substrate
结果
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fig.3
Detecting Single RAG–RSS Complexes in Real Time.
As such, we interpret these periods of reduced rms motion to be binding events that change the effective tether length by 64 ± 5 bp for a single 12RSS binding site and 57 ± 5 bp for a single 23RSS binding site
475 ± 5 bp
结果
482 ± 5 bp
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fig.5
Results
HMGB1 Alters the Binding Properties of RAG–RSS Complexes.
结果
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Results
We observe that HMGB1 alters the reduction in DNA tether length for RAG1/2c alone from 64 ± 5 bp and 57 ± 5 bp for a single 12RSS and 23RSS to 101 ± 8 bp and 132 ± 4 bp, respectively.
讨论
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Discussion
最后，我们通过观察珠子释放推断发夹结构的形成作为研究RAGHMGB1-RSS介导的DNA上的切割。在这些实验中，我们证实了珠释放 和RAG1 / 2c和HMGB1的浓度之间的关系。我们发现珠粒释放在含有 12RSS / 23RSS对的底物上被显着增强，需要催化活性RAG，并且当信 号间距离缩短超过以前显示抑制RAG介导的切割时V（D） J重组。利 用这些工具，现在可以对V（D）J反应过程进行大量的系统研究是有可 能的。我们的结果已经显示，大量的RSS和它们的序列可能改变重组动 力学，并且对确定在淋巴发育期间产生Ig和TCR基因的各种12/23规则调 节的V，D和J反应的突触和发夹形成的定量规则是有很大意义的。
Single-molecule analysis of RAG-mediated V(D)J DNA cleavage
PNAS 2015 112 (14) 4193-4194; doi:10.1073/pnas.ss11214
• reporter：
背景知识
V(D)J Recombination
Recombination Activating Gene
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fig.4
Results