90LS Sensor
散射光
散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上 的差异 - 通常使用“散点图”来看散射光信号 - 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数 据
散点图——Dot Plot
lysed whole blood
测得的FS与SS信号通 过计算机处理，可得到 FS-SS图，由此可仅用 散射光信号对未染色的 活细胞进行分析或分选。
光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
FS Detector
Laser
（1）激光光源
➢ 单波长、高强度、高稳定性
➢ 多采用氩离子激光器或氦氖激光器
➢ 一般选配2-4根激光，488nm 、633nm和 355nm、407nmUV激光
➢ 最多检测13个荧光参数
Optical Filters
- 相对细胞大小 - 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 - 染色过细胞的相对荧光强度
流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成
大小 粒度 DNA, RNA含量 蛋白质含量 钙离子, PH值, 膜电位
细胞功能
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原 细胞活性 胞内细胞因子 激素结合位点 酶活性
基础研究
淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干 细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相 关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究 （MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、 DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产 物测定、血管内皮细胞研究
假三维等高图
三参数直方图
（四）流式细胞仪的多参数分析
多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激 发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可 根据需要进行组合分析。
数据分析
设门 设定阴性与阳性群体的界限 确定阳性与阴性细胞群体 统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光
值，绝对数或抗体结合数
三、设门分析技术
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
LP 500
SP 500
BP500/50
光收集系统：光电倍增管 （PMT）
流式细胞仪的光信号
散射光信号 荧光信号
(2) 散射光信号
前向角散射光（FSC,Forward Scatter） 入射激光的同向散射光信号细胞相对大小及其表面积。
流式细胞术
徐琦 副教授
新疆医科大学 基础医学院免疫学教研室
第一节 流式细胞术概述
流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种 可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒 （通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特 定群体加以分选
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及 细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下， 通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种 信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
第四节 流式细胞样品制备
标本来源：
外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他 实验的不同，选用不同的抗凝剂。
可选的抗凝剂有： EDTA： 2mg/ml 枸椽酸钠：0.38% 肝素：15IU/ml
标本处理的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分钟。 注：不同的实验，所用的固定方法不完全相同。
partec流式细胞仪提供软件调节补偿技术，无论何时都 可重新调节
多色荧光补偿调节方法同双色法
3. 电子系统 主要由计算机及其软件组成
4. 细胞分选系统
Fluorescence Activated Cell Sorting
488 nm laser
- Charged Plates
Single cells sorted into test tubes
Gate设置：指在某一张选定参数的直方 图上，根据该图的细胞群分布选定其中 想要分析的特定细胞群，并要求该样本 所有其他参数组合的直方图只体现这群 细胞的分布情况。
根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆 形门、多边形门、任意形状门和十字门。
A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞
A、B、C均 为任意门
侧向角散射（SSC, Side Scatter） 入射激光90角的散射光信号细胞粒度及细胞内相对 复杂性。
前向角散射光 ——FSC
Forward Angle Light Scatter
Laser
FALS Sensor
侧向角散射光——SSC
Side Scatter
Laser
FALS Sensor
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
流式细胞仪
流式细胞仪 是测量染色细胞标记物荧光强度的 细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上 发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、 内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进 行快速测量并可分类收集的高技术。
BD LSR
通过流式细胞仪我们可以得到以下信息
线性门
Region设置:
区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个相 关的概念，区阈可与门对应，但是也可以 包含于门。
如十字门分析时，起 就可以由四个区域构 成，即 G=D1+D2+D3+D4。
D1 CD4+/CD3D2 CD4+/CD3+ D3 CD4- /CD3D4 CD4- /CD3+
方法二：密度离心法提取单个核细胞
Histopaque 1077为Ficoll与Sodium diatrizoate(泛影酸钠) 混合物，其密度为1.119～1.077。通过离心可将全血中的粒 细胞与单个核细胞分离。粒细胞沉积于1.119～1.077的血浆 层，而单个核细胞则在1.077以下的血浆层中。
（二）双参数直方图
双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的 两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在 图上的表达位置。
双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图， 在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度 反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。
双参数直方图点图
红
色
荧
光 强
➢便于数据统计
细胞分选系统
1. 液流系统
由样本和鞘液组成
待测细胞 单个细胞的悬液 抗对其染色 受清洁气体压力 动室形成样本流
荧光染料标记的单 从样品管进入流
鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包 裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置， 防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。
液流系统
液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处
基本工作原理
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
基本过程
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
流式细胞仪与显微镜的区别
区别 光源 对象 承载工具 检测信号 放大方式 统计 结果
样本处理标准试剂：
一、10%Bovine Serum Albumin BSA
1. 溶解10g BSA至100ml蒸馏水中 2. 4ºC，20000 g离心30分钟 3. 分装后-20ºC保存
二、0.1% BSA-PBS缓冲液
1. 准备500ml，PH7.3 PBS 2. 加入5ml 10% BSA 3. 使用0.45um滤网过滤
临床研究
淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分 析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、 PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因 子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flowFISH法测定端粒长度
第二节 流式细胞仪工作原理
一、工作原理
➢采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发 效率； ➢利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检 测的灵敏度和特异性； ➢用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数 信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确 性。
三、氯化铵溶血剂
1. 在一升蒸馏水中溶解8.29g NH4CL,1g KHCO3和37mg Na2EDTA 2. 调节PH值至7.2 3. 在使用前配置该溶血剂，并用0.45um滤膜过滤
收集白细胞
方法一：溶血法
1. 取100 ul抗凝全血； 2. 快速加入 2ml NH4CL溶血剂,混匀； 3. 室温孵育5分钟； 4. 4ºC，400g离心10分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS； 5. 4ºC，400g离心10分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS； 6. 4ºC，400g离心10分钟。去上清，调整细胞浓度至5x106/ml。
选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个 不同特征。
线性放大器和对数放大器
荧光信号
荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放，转换为
振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子
荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强
双色荧光散点图
荧光检测器
FALS Sensor
（一）单参数直方图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数 (COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强 度的颗粒数量的多少。
单参数直方图
X轴：代表荧光信
号或散射光信号的
强度，用“通道数”
量细 胞
表示，可以与光强
相
度之间线性关系或
对 数
对数关系
Y轴：代表该通道
内所出现具有相同
光信号特征性细胞
的频率
信道 (channel )
荧光补偿方法
➢所有补偿调为 “0”